Grüner Tee hemmt die Ausscheidung von Nephro

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 16226 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Chronische Nierenerkrankungen (CKD) sind weltweit ein großes Gesundheitsproblem. Indoxylsulfat (IS) und p-Kresylsulfat (PCS) sind stark proteingebundene nephrokardiovaskuläre Toxine, die durch Hämodialyse nicht effizient entfernt werden. Die renale Ausscheidung von IS und PCS wurde durch organische Anionentransporter (OATs) wie OAT1 und OAT3 vermittelt. Grüner Tee (GT) ist ein beliebtes Getränk, das reichlich Catechine enthält. Frühere pharmakokinetische Studien von Tees haben gezeigt, dass die wichtigsten im Blutkreislauf vorhandenen Moleküle die Glucuronide/Sulfate von Teecatechinen sind, die mutmaßliche Substrate von OATs sind. Hier haben wir gezeigt, dass die Einnahme von GT die systemische Exposition gegenüber endogenem IS und PCS bei Ratten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF) signifikant erhöhte. Noch wichtiger ist, dass GT auch die Serumkreatinin- (Cr) und Blut-Harnstoff-Stickstoffspiegel (BUN) bei CRF-Ratten signifikant erhöhte. Mechanismusstudien zeigten, dass die Serummetaboliten von GT (GTM) die Aufnahmetransportfunktionen von OAT1 und OAT3 hemmten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass GT die Ausscheidung von nephrokardiovaskulären Toxinen wie IS und PCS hemmte und die Nierenfunktion bei CRF-Ratten verschlechterte.

Chronische Nierenerkrankungen (CKD) beeinträchtigen die Gesundheit von immer mehr Menschen weltweit1. Das Hauptmerkmal im Endstadium der CKD ist die Anhäufung endogener urämischer Toxine2,3, darunter Indoxylsulfat (IS) und p-Kresylsulfat (PCS), die stark proteingebunden sind und nicht effizient durch Hämodialyse entfernt werden können4. Darüber hinaus waren die erhöhten Serumspiegel von IS und PCS mit dem Fortschreiten von CKD und Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) sowie der Gesamtmortalität verbunden5,6,7. Aufgrund der sauren Eigenschaften liegen IS und PCS als Anionen unter physiologischem pH-Wert im systemischen Kreislauf vor und der Aufnahmetransport von IS und PCS durch die Zellmembranen der proximalen Nierentubuli wurde durch organische Anionentransporter (OATs) wie OAT1 und OAT38 vermittelt ,9,10.

Dem gewohnheitsmäßigen Verzehr von Tees, Blättern und Knospen von Cammellia sinensis werden seit langem viele gesundheitliche Vorteile zugeschrieben, beispielsweise die Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs11,12. Grüner Tee (GT) ist einer der beliebtesten Tees und enthält reichlich Catechine wie (−)-Epicatechin (EC), (−)-Epigallocatechin (EGC), (−)-Epicatechin-3-gallat (ECG) und ( −)-Epigallocatechin-3-gallat (EGCG), die bis zu 30 % des Blatttrockengewichts ausmachen13. Frühere Studien zur Pharmakokinetik von Tee-Catechinen haben berichtet, dass EC-Glucuronide/Sulfate und EGC-Glucuronide/Sulfate die Hauptmoleküle im Blutkreislauf waren14,15,16. Aufgrund der anionischen Natur von Glucuroniden/Sulfaten unter physiologischem pH-Wert sind diese konjugierten Metaboliten von Teecatechinen mutmaßliche Substrate von OATs17. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass die Serummetaboliten von GT (GTM) den durch OAT1 und OAT3 vermittelten Aufnahmetransport von IS und PCS durch die Zellmembran des proximalen Nierentubulus hemmen könnten, was wiederum zu erhöhten Blutspiegeln von IS und PCS bei CKD führen würde Patienten mit geringerer OAT-Expression18,19 und fördern folglich das Fortschreiten von CKD und CVD.

Obwohl festgestellt wurde, dass GT bei gesunden Probanden eine schützende Wirkung auf die Nieren und das Herz-Kreislauf-System hat20,21,22, ist bisher nicht bekannt, ob GT CNI-Patienten wahrscheinlich einen Nutzen bringt. Frühere Studien haben berichtet, dass Ratten mit Adenin-induzierter chronischer Niereninsuffizienz (CRF) eine geringere Proteinexpression von OAT1 und OAT3 zusammen mit einer verringerten Clearance von IS und PCS zeigten19,23. Daher wurde in dieser Studie ein mit Adenin induziertes CRF-Rattenmodell eingesetzt, um die Wirkung von GT auf die Serumspiegel von endogenem IS und PCS zu untersuchen. Darüber hinaus wurde auch die Wirkung von GT auf die Nierenfunktion von CRF-Ratten untersucht. Darüber hinaus wurden Zellmodelle verwendet, um die Beteiligung von OAT1 und OAT3 am Mechanismus zu verifizieren.

Die GT-Infusion wurde mittels LC-MS/MS analysiert und die Chromatogramme sind in Abb. 1 dargestellt. Die Quantifizierungsergebnisse zeigten, dass die Konzentrationen von EC, EGC, ECG und EGCG 966,7, 919,9, 739,7 und 1960,1 μg/ml (3,33, 3,17) betrugen 2,55 bzw. 6,75 mM in der GT-Infusion.

LC-MS/MS-Chromatogramme von EC (1), EGC (2), ECG (3), EGCG (4) und 6,7-DMC (5, interner Standard) in GT-Infusion.

Zur Nachahmung der Moleküle, die mit OAT1 und OAT3 interagieren, die sich auf der Membran proximaler Nierentubuluszellen befinden, wurde GTM aus Ratten nach Erhalt einer GT-Infusion hergestellt. Die Charakterisierung von GTM ergab, dass die Konzentrationen der freien Formen von EC, EGC, ECG und EGCG 0,86, 2,17, 0,06 bzw. 0,13 μM betrugen. Nach der Hydrolyse mit Sulfatase/Glucuronidase waren alle Peaks von EC, EGC, ECG und EGCG verstärkt, insbesondere EC und EGC, wie in Abb. 2 dargestellt. Die Konzentrationen der freien Form und der Sulfate/Glucuronide jedes Tee-Catechins in GTM betragen Die in Tabelle 1 aufgeführten Verbindungen zeigen, dass die Hauptmoleküle in GTM die Sulfate/Glucuronide von EC und EGC waren. Die Konzentrationen der Sulfate/Glucuronide von EC, EGC, ECG und EGCG betrugen 32,47, 33,29, 0,13 bzw. 0,40 μM, die durch Subtrahieren der Konzentrationen in freier Form von denen nach der Hydrolyse erhalten wurden.

LC-MS/MS-Chromatogramme von EC (1), EGC (2), ECG (3), EGCG (4) und 6,7-DMC (5, interner Standard) im Serum vor (links) und nach der Behandlung mit Glucuronidase/ Sulfatase (rechts).

Die Analysemethoden von IS und PCS wurden in dieser Studie etabliert und validiert. Gute lineare Beziehungen bestanden in den Konzentrationsbereichen von 0,4–25,0 μg/ml (Y = 0,246 X + 0,006, r = 0,9999) für IS und 0,3–20,0 μg/ml (Y = 0,045 X + 0,010, r = 0,9996) für PCS im Serum. Die Validierung der Analysemethoden für IS ergab, dass die Variationskoeffizienten (CVs) der Intraday- und Interday-Analyse unter 6,4 % bzw. 7,6 % lagen und die relativen Fehler (RE) unter 12,1 % bzw. 9,9 % lagen. Die CVs der PCS der Intraday- und Interday-Analyse lagen unter 17,0 % und 12,6 % und die RE lagen unter 10,9 % und 7,8 %. Die Wiederfindungen von IS bei 0,8, 3,1 und 12,5 μg/ml aus Serum betrugen 88, 101 und 100 % und die von PCS bei 0,6, 2,5 und 10,0 μg/ml betrugen 104, 103 und 105 %. Die LLOQ von IS und PCS betrugen 0,4 und 0,3 μg/ml und die LOD betrug 0,01 und 0,04 μg/ml.

Die Dosierungszeiten von Adenin und GT sowie der geplante Zeitpunkt der Blutentnahme sind in Abb. 3 zusammengefasst. Nach Verabreichung von fünf aufeinanderfolgenden Adenindosen war der mittlere Serum-IS-Spiegel bei 28 Ratten signifikant von 6,85 auf 15,35 μM erhöht (P < 0,001) und der PCS-Spiegel stiegen am Tag 4 von 5,59 auf 7,49 μM (P = 0,14), wie in Abb. 4 dargestellt. Die Serumprofile von endogenem IS und PCS bei CRF-Ratten nach oraler Verabreichung von GT bei 200 und 400 mg/kg sind in Abb. 5 dargestellt. Die Profile zeigten deutlich, dass die Einnahme von GT dosisabhängig die Serumspiegel von IS und PCS erhöhte. Die pharmakokinetischen Parameter von IS und PCS sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Einnahme von 400 mg/kg GT die AUC0-360 von IS und PCS signifikant um 139,2 % bzw. 118,4 % erhöhte und die Cmax von IS um 123,3 erhöhte %, wohingegen der Cmax von PCS nicht beeinflusst wurde. Im Gegensatz dazu waren die Profile von IS und PCS bei Gabe von GT in einer niedrigeren Dosis von 200 mg/kg höher als die Kontrollkurven, allerdings erreichten die Unterschiede von Cmax und AUC0-360 keine statistische Signifikanz.

Geplanter Zeitpunkt der Blutentnahme (▲) und Dosierungszeitpunkt von Adenin und GT ( ↑).

Mittlere (±SE) Serum-IS- (links) und PCS-Konzentrationen (rechts) bei 28 Ratten vor und nach der Verabreichung von sieben Dosen Adenin (15 mg/Ratte).***P < 0,001.

Mittlere (± SE) Serumkonzentration – Zeitprofile von endogenem IS (links) und PCS (rechts) nach Verabreichung der 7. Dosis von 400 mg/kg GT (•, n = 10), 200 mg/kg GT (▽ , n = 8) und Wasser (○, n = 10) bei CRF-Ratten.

Nach der Verabreichung von fünf aufeinanderfolgenden Dosen Adenin war der mittlere Cr von 14 Ratten signifikant von 0,30 auf 0,58 mg/dl und der BUN-Wert am 4. Tag von 21,0 auf 60,1 mg/dl erhöht. Die Konzentrationen von Cr und BUN bei CRF-Ratten danach Die durchschnittlichen Werte für Cr und BUN in der GT-Gruppe betrugen 0,79 bzw. 55,1 mg/dl und waren damit deutlich höher als in der Wassergruppe (0,49 bzw. 40,9 mg/dl).

Die Auswirkungen von GTM auf die Aufnahmeaktivität von hOAT1 und hOAT3 sind in Abb. 6 dargestellt. GTM bei 1/4-, 1/2- und 1-fachen Serumkonzentrationen reduzierte die intrazelluläre Akkumulation von 6-CF, einem OAT1-Substrat, signifikant. um 43,9, 41,9 bzw. 58,1 % im Vergleich zu leeren Serumproben bei entsprechenden Konzentrationen. Ebenso reduzierte GTM bei 1/2- und 1-facher Serumkonzentration die intrazelluläre Akkumulation von 5-CF, einem OAT3-Substrat, signifikant um 36,4 % bzw. 31,3 % im Vergleich zu leeren Serumproben bei entsprechender Konzentration. Als positive Kontrollinhibitoren von hOAT1 und hOAT3 reduzierte Probenecid (80 μM) die intrazelluläre Akkumulation von 6-CF und 5-CF signifikant um 50,4 bzw. 50,7 %. Diese In-vitro-Studien zeigten, dass GTM den durch hOAT1 und hOAT3 vermittelten Aufnahmetransport signifikant hemmte.

Auswirkungen von GTM (1-, 1/2- und 1/4-fache Serumkonzentrationen) und Probenecid (Prob, 80 μM) auf die intrazelluläre Akkumulation von 6-CF in CHO-hOAT1-Zellen (links) und 5-CF in HEK293-hOAT3 Zellen (rechts).

*P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001.

Die Quantifizierungsergebnisse zeigten, dass EGCG das Hauptkatechin des Tees in der GT-Infusion war, wohingegen die Hauptmoleküle in GTM die Sulfate/Glucuronide von EC und EGC waren. Diese Erkenntnisse stimmten weitgehend mit den zuvor gemeldeten Ergebnissen überein16. Basierend auf diesen Fakten konnten wir schließen, dass ECG und EGCG möglicherweise durch Esterase hydrolysiert wurden, um EC bzw. EGC zu bilden, die dann durch Konjugationsreaktionen umfassend metabolisiert wurden, um EC-Sulfate/Glucuronide und EGC-Sulfate/Glucuronide als die darin zirkulierenden Hauptmoleküle zu ergeben der Blutkreislauf.

Im Hinblick auf die Quantifizierung von IS und PCS im Serum wurden in dieser Studie aufgrund der unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften zwischen IS und PCS zwei HPLC-Methoden entwickelt und optimiert, die unterschiedliche interne Standards und Detektionswellenlängen verwenden. Die Validierung der Analysemethoden bestätigte, dass Präzision, Genauigkeit und Wiederfindung für die Quantifizierung von IS und PCS im Serum zufriedenstellend waren.

Im klinischen Umfeld sind CNI-Patienten häufig erhöhten Blutspiegeln endogener urämischer Toxine wie IS und PCS ausgesetzt, die Nebenprodukte des Proteinstoffwechsels sind24,25. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde berichtet, dass die Serumkonzentrationen von IS und PCS bei gesunden Probanden 1,03 und 13,03 μM betrugen26. Im Gegensatz dazu betrugen die Serumkonzentrationen von IS und PCS bei nicht hämodialysierten CKD-Patienten im Stadium 3–5 17,45 und 73,47 μM, während sie bei den CKD-Patienten, die sich einer Hämodialysebehandlung unterzogen (Stadium 5D), 81,04 und 120,54 μM betrugen26. Dies unterstreicht die Tatsache, dass IS und PCS stark an Proteine gebunden sind (89 % und 96 %) und daher nicht effizient durch Hämodialyse entfernt werden27,28,29,30. Im Hinblick auf die relative Häufigkeit von IS und PCS im Blut wurde festgestellt, dass der IS-Spiegel bei Ratten durchweg höher war als der PCS-Spiegel31,32,33, was im Gegensatz zum Menschen zu stehen scheint. Diese Diskrepanz zwischen Ratten und Menschen könnte auf den Artenunterschied im Proteinstoffwechsel zurückzuführen sein23,27,34.

Um den biologischen Zustand von CKD mit geringerer Expression von OATs nachzuahmen, wurde in dieser Studie Adenin zur Induktion von CRF verwendet19,23,35,36. Die Serumspiegel von IS und PCS waren bei unseren CRF-Ratten auf 15,4 und 7,6 μM erhöht, was weitgehend den Werten früherer Studien entsprach31,32,33. Andererseits waren die Cr- und BUN-Spiegel im Serum signifikant erhöht, was darauf hindeutet, dass die Nierenfunktion von Ratten durch Adenin beeinträchtigt wurde36,37. Nachdem den CRF-Ratten sieben GT-Dosen verabreicht wurden, erhöhte die höhere GT-Dosis von 400 mg/kg die systemische Exposition gegenüber IS und PCS signifikant, wohingegen die niedrigere Dosis von 200 mg/kg nicht zu signifikanten Erhöhungen führte, was auf einen großen Anstieg hindeutet Die Menge an GT hemmte die Eliminierung von IS und PCS. Darüber hinaus waren die Cr- und BUN-Werte im Serum um 400 mg/kg GT signifikant erhöht, was darauf hindeutet, dass GT die Nierenfunktion von CRF-Ratten verschlechterte, was möglicherweise auf die erhöhte systemische Exposition gegenüber urämischen Toxinen wie IS und PCS zurückzuführen ist.

Es ist bekannt, dass der Aufnahmetransport von IS und PCS durch die Zellmembran durch OAT1 und OAT38,9 vermittelt wird. Im Hinblick auf das Ausmaß der Einflüsse zeigte sich, dass die Wirkung von GT auf die Serumspiegel von IS größer war als die von PCS. Es wurde berichtet, dass die Aufnahme von IS durch OAT1 und OAT3 mit Km-Werten von 21 μM bzw. 263 μM sättigbar war38. In Bezug auf PCS betrug der Km-Wert für die OAT1-vermittelte Aufnahme 128 μM, während für den OAT3-vermittelten Transport bis zu 5 mM keine Sättigung beobachtet wurde39. Angesichts der niedrigeren Km-Werte von IS als PCS sowohl bei der OAT1- als auch bei der OAT3-vermittelten Aufnahme sollte IS ein Substrat für OAT1 und OAT3 mit geringerer Kapazität sein. Daher waren die durch OAT1 und OAT3, insbesondere OAT1, vermittelten Aufnahmetransporte von IS leichter zu sättigen als die von PCS, was dafür verantwortlich sein kann, dass GT die Serumspiegel von IS stärker erhöhte als PCS.

Um die beteiligten Mechanismen zu untersuchen, wurde GTM vorbereitet, um die Moleküle nachzuahmen, die mit renalem OAT1 und OAT340,41 interagieren. Die Charakterisierung von GTM zeigte, dass die Hauptmoleküle im Serum EC-Glucuronide/Sulfate und EGC-Glucuronide/Sulfate waren, was die Ergebnisse früherer Studien widerspiegelte14,16. Zelllinienstudien, die zeigen, dass GTM den durch OAT1 und OAT3 vermittelten Aufnahmetransport hemmt, könnten die durch GT verursachten erhöhten Serumspiegel von IS und PCS erklären. Wir spekulierten, dass diese mit OAT1 und OAT3 bei CRF-Ratten verbundenen Mechanismen auf CNE-Patienten übertragen werden könnten, da die Verteilung und Funktion von OATs in der Rattenniere denen beim Menschen ähnlich sind42,43,44.

Trotz verschiedener gesundheitlicher Vorteile des Teekonsums für gesunde Menschen20,21,22 zeigte die vorliegende Studie, dass GT die Eliminierung von neprovaskulären Toxinen wie IS und PCS hemmte und die Nierenfunktion bei CRF-Ratten verschlechterte. In Anbetracht der Tatsache, dass hohe Blutspiegel von IS und PCS den oxidativen Stress, Entzündungsmediatoren und Chemokine im Körper erhöhen45, vermuten wir, dass der Verzehr großer Mengen GT dazu führen könnte, dass das Fortschreiten von CNI und CVD bei CNI-Patienten gefördert wird. Darüber hinaus könnte der GT-Konsum aufgrund der ineffizienten Entfernung von IS und PCS durch Hämodialyse auch die Pathologien von CKD und CVD bei CKD-Patienten im Endstadium verschlimmern, selbst unter Hämodialysebehandlung5,6,7. Daher schlagen wir vor, dass CNI-Patienten den Konsum größerer Mengen an Teegetränken vermeiden sollten, bevor die Vorteile oder Risiken für CNI-Patienten durch zukünftige klinische Studien beurteilt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass GT die Eliminierung von nephrokardiovaskulären Toxinen wie IS und PCS durch Hemmung von OAT1 und OAT3 hemmte und die Nierenfunktion bei CRF-Ratten verschlechterte.

GT wurde auf dem Markt in Taichung, Taiwan, gekauft. IS (Reinheit 97 %) wurde von Alfa Aesar (Lancaster, UK) erhalten. 6,7-Dimethoxycumarin (6,7-DMC, Reinheit 98 %) wurde von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) geliefert. EC (Reinheit 90 %), ECG (Reinheit 98 %), EGCG (Reinheit 95 %), Ameisensäure, Probenecid, Phosphorsäure (Eissäure, 85 %) und Methylparaben wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). EGC (Reinheit 92,7 %) wurde von ChromaDex, Inc. (Irvine, CA, USA) erhalten. und Ethylacetat hatten LC-Qualität und wurden von ECHO Chemical Co. (Miaoli Hsien, Taiwan) bezogen. Acetonitril hatte LC/MS-Qualität und wurde von Millinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, USA) bezogen. Fötales Rinderserum wurde von Biological Industries Inc. (Kibbuz, Beit Haemek, Israel) bezogen. Penicillin-Streptomycin-Glutamin, Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, Trypsin/EDTA, Hank's Balanced Salt Solution und 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) bezogen. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium F12 wurde von Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) bezogen. 6-Carboxyfluorescein wurde von AAT Bioquest Inc. (Sunnyvale, CA, USA) gekauft und 5-Carboxyfluorescein wurde von Acros Organics (Geel, Belgien) bezogen. Für alle Zubereitungen wurde Milli-Q plus Wasser (Millipore, Bedford, MA, USA) verwendet.

Die Infusion wurde durch 30-minütiges Einweichen von entweder 2 oder 4 g GT in 50 ml heißem entionisiertem Wasser (98–100 °C) hergestellt. Die Infusion wurde im heißen Zustand mit Gaze filtriert, um Konzentrationen von 40 bzw. 80 mg/ml zu erhalten, die den Ratten frisch über eine Magensonde verabreicht wurden.

Zur Charakterisierung der GT-Infusion wurden nach der Filtration der GT-Infusion mit einem 0,2 μm RC15-Filter (Sartorious, Göttingen, Deutschland) 100 μl des Filtrats mit 900 μl Methanol gemischt und zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen. Die ordnungsgemäß verdünnte Infusion (50 μl) wurde mit 50 μl 6,7-DMC-Lösung (2,0 μg/ml in Methanol) als interner Standard kombiniert und 5 μl wurden einer LC-MS/MS-Analyse unterzogen. Das HPLC-System umfasste eine Accela 1250-Pumpe und einen automatischen Probengeber (Thermo Fisher Scientific Inc. USA). Die chromatographische Trennung wurde mithilfe einer Phenomenex® C18-Analysesäule (150 mm × 1,0 mm, 5 μm) mit einem Vorfilter erreicht. Die mobile Phase bestand aus Acetonitril mit 0,01 % Ameisensäure (A) und Wasser mit 0,01 % Ameisensäure (B) und wurde in einem Gradienten wie folgt programmiert: A/B: 2/98 (0–2 Min.), 15/85 (4 Min.), 40/60 (6 Min.), 90/10 (8–10 Min.) und 2/98 (12 Min.). Die Flussrate betrug 0,2 ml/min. Der Säulenausfluss wurde mit einer H-ESI-Sonde (Heated-Electrospray Ionization)-II mit einem dreistufigen Quadrupol-Massenspektrometer (TSQ) Quantum Access MAX (Thermo Fisher Scientific Inc. USA) nachgewiesen. Stickstoff wurde als Hüllgas in 35 willkürlichen Einheiten und Hilfsgas in 10 willkürlichen Einheiten verwendet. Die Kollisionsenergie wurde auf –19/18 V, die Sprühspannung auf –3000/3000 V, die Kapillartemperatur auf 350 °C, die Verdampfertemperatur auf 350 °C und der Tubuslinsenversatz auf –80/88 V eingestellt. Die folgenden Massenübergänge waren Wird für ausgewählte Reaktionsüberwachungsanalysen (SRM) verwendet: EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) und 6,7-DMC (207/151). Die ESI-MS-Spektren wurden im negativen Ionenmodus für EC, EGC, ECG und EGCG und im positiven Ionenmodus für 6,7-DMC aufgezeichnet.

Männliche Sprague-Dawley-Ratten (270–360 g) wurden vom National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) gekauft und in einer klimatisierten Umgebung mit 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklen gehalten. Nahrung und Wasser wurden bis 12 Stunden vor den Experimenten nach Belieben erworben. Die Ratten wurden in zwei Gruppen eingeteilt. Im ersten Experiment wurden 28 Ratten verwendet, um die Wirkung von GT auf die Serumspiegel von IS und PCS bei CRF-Ratten zu bestimmen. Im zweiten Experiment wurden 14 Ratten verwendet, um die Wirkung von GT auf die Nierenfunktion von CRF-Ratten zu bewerten. Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des „Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals (2002)“ durchgeführt, herausgegeben von der Chinese Society of Animal Science, Taiwan, ROC. Das Versuchsprotokoll wurde überprüft und genehmigt am 01.08.2014 (Genehmigungsnummer: 103–126-N) durch das Institutional Animal Care and Use Committee der China Medical University, Taiwan, ROC

CRF wurde nach früheren Studien durch orale Verabreichung von Adenin induziert, jedoch mit einigen Modifikationen19,23,35,36. Kurz gesagt, Adenin, suspendiert in 0,5 % Methylcellulose 400 (15 mg/ml), wurde 28 Ratten über die Magensonde zweimal täglich in sieben aufeinanderfolgenden Dosen (15 mg/Ratte) während des gesamten Versuchszeitraums oral verabreicht. Am 4. Tag wurden die IS-Serumspiegel bestimmt. Nach Bestätigung einer verminderten Nierenfunktion durch einen signifikanten Anstieg der Serum-IS-Spiegel wurden die CRF-Ratten in drei Gruppen (8–10 Ratten in jeder Gruppe) mit vergleichbaren IS-Spiegeln eingeteilt. Die erste Gruppe erhielt zweimal täglich 400 mg/5 ml/kg GT-Infusion über sieben aufeinanderfolgende Dosen; Die zweite Gruppe erhielt zweimal täglich 200 mg/5 ml/kg GT über sieben aufeinanderfolgende Dosen. und die dritte Gruppe erhielt parallel 5 ml/kg Wasser als Kontrolle. Am 8. Tag wurde den Ratten um 9:00 Uhr nach dem Fasten über Nacht die 7. GT-Dosis verabreicht und die Blutproben wurden 0, 15, 30, 60, 120, 180 und 360 Minuten nach der Dosierung entnommen. Der geplante Zeitpunkt der Blutentnahme und der Verabreichung von Adenin und GT ist in Abb. 3 zusammengefasst. Zu jedem Probenahmezeitpunkt wurden 0,5 ml Blut unter Isoflurananästhesie entnommen. Die Blutproben wurden in Mikroröhrchen gesammelt und 15 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert, um Serum zu erhalten, das vor der Analyse bei –20 °C gelagert wurde.

Zur Bestimmung der IS- und PCS-Konzentrationen im Serum wurden 50 μl Serumproben mit 200 μl Methanol, das 10 μg/ml 6,7-DMC bzw. 100 μg/ml Methylparaben als interne Standards enthielt, vortexiert und zur Entfernung zentrifugiert Nach dem Niederschlag wurde ein Aliquot von 20 μl einer HPLC-Analyse unterzogen.

Für die Kalibratorzubereitung wurden 50 μl Serum mit einer Reihe von Konzentrationen von IS und PCS versetzt, um Konzentrationsbereiche von 0,4–25,0 μg/ml (1,8–117,3 μM) und 0,3–20,0 μg/ml (1,7–106,3 μM) zu erhalten. jeweils. Das spätere Verfahren folgte dem oben für Serumproben beschriebenen. Die Kalibrierungskurven wurden durch lineare Regression der Peakflächenverhältnisse (IS oder PCS zu internem Standard) gegen die bekannten Konzentrationen von IS bzw. PCS erstellt.

Das HPLC-Gerät umfasste eine Pumpe (LC-10AT, Shimadzu, Kyoto, Japan), einen Fluoreszenzdetektor (RF-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan) und einen automatischen Injektor (SIL-10AF, Shimadzu, Kyoto, Japan). Die Apollo C18-Säule (5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, USA) war mit einer Schutzsäule (4,6 × 50 mm, 5 μm) (GL Science Inc., Tokio, Japan) ausgestattet. Die mobile Phase bestand aus Acetonitril (A) – 0,1 % Phosphorsäure (B) und wurde in einem Gradienten wie folgt programmiert: A/B: 15/85 (0–7 Min.), 30/70 (9–22 Min.) und 15/85 (24–35 Min.) für IS und 16/84 (0–10 Min.), 30/70 (13–22 Min.) und 16/84 (24–36 Min.) für PCS. Die Detektoreinstellungen waren Ex 280 nm/Em 375 nm für IS und Ex 214 nm/Em 306 nm für PCS. Die Flussraten betrugen 1,0 ml/min.

In einem anderen Experiment wurde das gleiche oben erwähnte Tierprotokoll angewendet und die Konzentrationen von Cr und BUN wurden vor der Adeninbehandlung (Tag 0), vor der GT-Dosierung (Tag 4) und nach der 7. GT-Dosis (Tag 8) bestimmt. Nach Bestätigung der verminderten Nierenfunktion durch signifikante Erhöhung von Cr und BUN am Tag 4 wurden die CRF-Ratten in zwei Gruppen (7 Ratten pro Gruppe) mit vergleichbaren Cr-Werten aufgeteilt. Die erste Gruppe erhielt zweimal täglich 400 mg/5 ml/kg GT über sieben aufeinanderfolgende Dosen; Die zweite Gruppe erhielt als Kontrolle parallel 5 ml/kg Wasser. Am 8. Tag wurde den Ratten nach Fasten über Nacht die 7. Dosis GT und Wasser verabreicht und die Blutproben wurden 30 Minuten später entnommen. Cr wurde durch eine kinetische alkalische Pikratmethode in einem ADVIA 2400 Chemistry System (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, USA) bestimmt. BUN wurde durch die Urease/Glutamatdehydrogenase-gekoppelte Enzymreaktion unter Verwendung desselben Analysegeräts untersucht.

Konstruktion der stabil transfizierten Zelllinien, die für Transportstudien verwendet werden: Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO), die hOAT1 (CHO-hOAT1) exprimieren, menschliche embryonale Nierenzellen 293 (HEK), die hOAT3 (HEK-hOAT3) exprimieren, und ihre entsprechende leere vektortransfizierte Kontrolle Zelllinien, wurde bereits zuvor beschrieben40,41. CHO-Zellen wurden bei 37 °C mit 5 % CO2 in DMEM F-12-Medium (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) gehalten, das 10 % Serum, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 mg/ml G418 enthielt. HEK-Zellen wurden bei 37 °C mit 5 % CO2 in DMEM-Medien mit hohem Glucosegehalt (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) gehalten, die 10 % Serum, 1 % Penicillin/Streptomycin und 50 μg/ml Hygromycin B enthielten. Die Zellen wurden in Poly- Mit D-Lysin beschichtete Gerichte.

Um die Moleküle nachzuahmen, die in vivo mit OATs interagieren, wurden GTM aus Ratten hergestellt und charakterisiert. Kurz gesagt wurde Ratten, die über Nacht nüchtern waren, eine GT-Infusion (800 mg/10 ml/kg) oral verabreicht. 15 Minuten nach der Verabreichung der GT-Infusion wurde Blut entnommen. Nach der Koagulation wurde das Serum gesammelt und mit dreifachem Methanol verrührt. Nach 15-minütiger Zentrifugation bei 10.000 g wurde der Überstand in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Dem Rückstand wurde ein entsprechendes Volumen Wasser zugesetzt, was eine Lösung mit der 10-fachen Serumkonzentration ergab, die in Aliquots aufgeteilt und zur späteren Verwendung bei –80 °C gelagert wurde.

Ein Teil des GTM wurde nach einer früheren Methode mit einigen Modifikationen charakterisiert16,46. Kurz gesagt, 100 μl Serumprobe wurden mit 50 μl Sulfatase (enthaltend 1000 Einheiten/ml Sulfatase und 39.861 Einheiten/ml ß-Glucuronidase), 50 μl Ascorbinsäure (200 mg/ml) gemischt und bei 37 °C inkubiert für 45 Minuten unter anaeroben Bedingungen. Nach der Hydrolyse wurde das Serum zu 50 μl 0,1 N HCl gegeben und dann mit 250 μl Ethylacetat (enthaltend 100 ng/ml 6,7-DMC als interner Standard) verteilt. Die Ethylacetatschicht wurde unter N2 zur Trockne eingedampft und vor der LC-MS/MS-Analyse mit einem geeigneten Volumen mobiler Phase rekonstituiert. Die mobile Phase bestand aus Acetonitril (A) – Wasser mit 0,1 % Ameisensäure (B) und wurde in einem Gradienten wie folgt programmiert: A/B: 2/98 (0–2 Min.), 15/85 (4 Min.), 40/60 (6 Min.), 90/10 (8–10 Min.) und 2/98 (12 Min.). Die Flussrate betrug 0,2 ml/min.

CHO-hOAT1- und HEK-hOAT3-Zellen (1 × 105 Zellen/Vertiefung) wurden in einer Platte mit 96 Vertiefungen kultiviert. 6-Carboxyfluorescein (6-CF) und 5-Carboxyfluorescein (5-CF) wurden als Sonden zur Bewertung der Wirkung von GTM auf die Aktivität von hOAT1 bzw. hOAT347,48 verwendet. Darüber hinaus wurde Probenecid (80 μM) als Positivkontrolle zur Hemmung von hOAT1 und hOAT349 verwendet. Nach 24-stündiger oder 48-stündiger Inkubation von CHO-hOAT1 oder HEK-hOAT3 wurde das Medium entfernt und dreimal mit PBS-Puffer gewaschen. Vor dem Transportexperiment wurden CHO-hOAT1- und HEK-hOAT3-Zellen mit Testsubstanzen (GTM und Probenecid) bei 37 °C vorinkubiert. Nach 30-minütiger Inkubation wurde dann 6-CF oder 5-CF zugegeben und weitere 5 bzw. 10 Minuten inkubiert. Die Platten wurden sofort auf ein Eisbad gestellt, die Überstände entfernt und die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Anschließend wurden 100 μL 0,1 % Triton X-100 zur Lyse der Zellen zugegeben und die Fluoreszenz mit Anregung bei 485 nm und Emission bei 528 nm gemessen. Um den Proteingehalt in jeder Vertiefung zu quantifizieren, wurden 10 μl Zelllysat zu 200 μl verdünntem Proteintestreagenz (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) gegeben und die optische Dichte bei 570 nm gemessen. Die relative intrazelluläre Akkumulation von 6-CF oder 5-CF wurde durch Vergleich mit der von Kontrollen nach Proteinkorrektur berechnet.

Die maximale Serumkonzentration (Cmax) wurde aus experimenteller Beobachtung ermittelt. Die Fläche unter der Serumkonzentrations-Zeit-Kurve (AUC0-t) wurde mithilfe der Trapezregel bis zum letzten Punkt berechnet. Die Unterschiede von IS und PCS zwischen drei Gruppen wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA analysiert, während der Unterschied von Cr und BUN zwischen zwei Gruppen mithilfe des ungepaarten Student-t-Tests analysiert wurde, wobei p < 0,05 als signifikantes Niveau angenommen wurde. Der ungepaarte Student-T-Test wurde auch für die Analyse von In-vitro-Tests verwendet.

Zitierweise für diesen Artikel: Peng, Y.-H. et al. Grüner Tee hemmte die Ausscheidung nephrokardiovaskulärer Toxine und verschlechterte die Nierenfunktion bei Ratten mit Nierenversagen. Wissenschaft. Rep. 5, 16226; doi: 10.1038/srep16226 (2015).

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Die Arbeit wurde teilweise vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, ROC (MOST 103-2320-B-039-025 und NSC 102-2320-B-039-014-MY2) und der China Medical University, Taichung, Taiwan, unterstützt , ROC (CMU 103-N-01) und China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan, ROC (DMR-104-092).

Fakultät für Pharmazie, China Medical University, Taichung, Republik China, Taiwan

Yu-Hsuan Peng, Shiuan-Pey Lin, Chung-Ping Yu, Pei-Dawn Lee Chao und Yu-Chi Hou

Abteilung für Pharmazeutik, Virginia Commonwealth University, Richmond, USA

Douglas H. Sweet

Abteilung für Pharmazie, China Medical University Hospital, Taichung, Republik China, Taiwan

Yu-Chi Hou

Abteilung für medizinische Forschung, China Medical University Hospital, Taichung, Republik China, Taiwan

Yu-Chi Hou

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Y.-HP trug zum Studiendesign und zur Formulierung des Artikels bei. Das DHS konstruierte die transfizierten Zelllinien und überarbeitete das Manuskript. S.-PL und C.-PY waren an der experimentellen Arbeit beteiligt. P.-DLC und Y.-CH leisteten Beiträge zur Konzeption, zum Studiendesign und zur Betreuung des Manuskripts.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Dieses Werk ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe nichts anderes angegeben ist; Wenn das Material nicht unter der Creative-Commons-Lizenz enthalten ist, müssen Benutzer die Erlaubnis des Lizenzinhabers einholen, um das Material zu reproduzieren. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Nachdrucke und Genehmigungen

Peng, YH., Sweet, D., Lin, SP. et al. Grüner Tee hemmte die Ausscheidung nephrokardiovaskulärer Toxine und verschlechterte die Nierenfunktion bei Ratten mit Nierenversagen. Sci Rep 5, 16226 (2015). https://doi.org/10.1038/srep16226

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Eingegangen: 27. Mai 2015

Angenommen: 12. Oktober 2015

Veröffentlicht: 10. November 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep16226

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Klinische Pharmakokinetik (2017)

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