Impfstoff plus Mikrobizid verhindern wirksam die vaginale SIV-Übertragung bei Makaken

Nature Microbiology Band 8, Seiten 905–918 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Epidemie des Humanen Immundefizienzvirus hält in Afrika südlich der Sahara an und betrifft insbesondere heranwachsende Mädchen und Frauen, die nur begrenzten Zugang zu einer antiretroviralen Therapie haben. Hier berichten wir, dass das Risiko einer Ansteckung mit dem vaginalen Simian Immunodeficiency Virus (SIV) mac251 um mehr als 90 % reduziert wird, wenn eine Kombination aus einem Impfstoff mit V1-deletierten (V2-verstärkten) SIV-Hüllimmunogenen und einer topischen Behandlung mit dem Zinkfinger-Inhibitor SAMT eingesetzt wird -247. Nach 14 wöchentlichen intravaginalen Expositionen gegenüber dem hochpathogenen SIVmac251 blieben 80 % einer Kohorte von 20 geimpften und mit SAMT-247 behandelten Makaken nicht infiziert. In einer Gruppe von 18 nur geimpften Tieren ohne Mikrobizid blieben 40 % der Makaken nicht infiziert. Das kombinierte SAMT-247/Impfstoff-Regime war deutlich wirksamer als die alleinige Impfung. Durch die Analyse von Immunkorrelaten des Schutzes zeigen wir, dass SAMT-247 durch die Erhöhung der Zinkverfügbarkeit die Zytotoxizität natürlicher Killer und die Monozyten-Efferozytose erhöht und die T-Zell-Aktivierung verringert, um den durch den Impfstoff induzierten Schutz zu verstärken.

Obwohl die verfügbaren Behandlungen dazu geführt haben, dass die HIV-Neuinfektionen gegenüber dem Höchststand von 3,2 Millionen im Jahr 1996 um 54 % im Jahr 2021 zurückgegangen sind, verursacht eine Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) weiterhin eine erhebliche Morbidität und Mortalität. Im Jahr 2021 haben sich schätzungsweise 1,5 Millionen Menschen weltweit mit HIV infiziert (Ref. 1). Frauen sind nicht nur biologisch anfälliger für eine HIV-1-Infektion als Männer, sondern sie sind oft auch sozial und kulturell anfälliger für eine Infektion1. Ungefähr 5.000 Frauen im Alter von 15 bis 24 Jahren infizieren sich weltweit jede Woche mit HIV, und in Afrika südlich der Sahara treten sechs von sieben neuen HIV-Infektionen bei Jugendlichen bei Mädchen auf1,2. Ein wirksamer HIV-Impfstoff wird dringend benötigt, insbesondere um die Krankheitslast bei Frauen zu verringern und die HIV-Epidemie einzudämmen.

Von den neun klinischen Studien zur Wirksamkeit des HIV-Impfstoffs, die bisher am Menschen durchgeführt wurden3,4,5,6,7,8,9,10,11,12, zeigte nur der RV144-Kanarienpocken-basierte (ALVAC)-Impfstoff ein mäßiges Maß an gleichwertiger Wirksamkeit bei Männern und Frauen8. Die ALVAC-basierte/gp120/Alaun-Impfstoffplattform, die virusähnliche Partikel kodiert, reduzierte die Virusansteckung beim Menschen in einer Phase-III-Wirksamkeitsstudie8 um 31,2 %.

Das Makakenmodell hat das präklinische Potenzial der mit gp120 verstärkten Impfstoffmodalität ALVAC/Affenimmunschwächevirus (SIV) überzeugend demonstriert (Ref. 13), indem es die Wirksamkeit der erfolgreichen RV144-HIV-Impfstoffstudie reproduzierte, in der das Alaun-Adjuvans8 getestet und das Scheitern vorhergesagt wurde der HVTN-702-Studie in Südafrika unter Verwendung des MF59-Adjuvans10. Darüber hinaus hat die Arbeit in diesem Modell gezeigt, dass die Wirksamkeit von ALVAC-basierten HIV-Impfstoffkandidaten durch die Verwendung eines DNA-Primers14, die Vereinfachung des Impfschemas15 und durch eine bessere Darstellung der α-helikalen Konformation der variablen Region 2 (V2) über die verbessert werden kann Streichung von V1 (Ref. 16). Bei geimpften Makaken korrelierte V2-spezifisches ADCC mit einem verringerten Risiko einer Virusansteckung16, was mit den primären und sekundären Risikokorrelaten in RV144 übereinstimmt (Lit. 17). Sowohl menschliche als auch Makaken-Antikörper, die die α-helikale Konformation von V2 erkennen, hemmen die V2-vermittelte CD4+-T-Zell-Kostimulation und die CCR5-Expression18. Systembiologische und funktionelle Analysen von CD14+-Zellen in geimpften Makaken zeigten, dass die Wirksamkeit der verbesserten DNA/ALVAC gp120/Alaun-Plattform auf der Aktivierung der entzündungshemmenden CCR2/CCL2-Achse15,19 und der Aktivierung des c-AMP/CREB1-Signalwegs beruht in entzündungshemmenden (M2-ähnlichen) Monozyten20 und Monozyten-Efferozytose15,21, die für die Clearance apoptotischer Zellen22 erforderlich sind. Darüber hinaus sind bei Makaken auch die durch den Impfstoff induzierte Rekrutierung von NKp44-IL-17+-Zellen an Schleimhautstellen und die verringerte Expression von CCR5 auf Th1- und Th2-Zellen mit einem verringerten Risiko einer Virusansteckung korreliert13,14,23.

Obwohl die wichtigsten Immunkorrelate des Risikos zunehmend verstanden werden, bleibt die Wirksamkeit des ∆V1DNA/ALVAC/∆V1gp120/Alaun-Impfstoffschemas sowohl bei weiblichen als auch bei männlichen Makaken suboptimal und verringert das Pro-/Expositionsrisiko einer Virusansteckung um durchschnittlich 70 % und schützt etwa die Hälfte der geimpften Tiere vor dem Erwerb von SIVmac25115. Das Mikrobizid SAMT-247 (S-Acyl-2-mercaptobenzamidthioester) zielt insbesondere auf die mutationsintoleranten Zinkfinger des HIV-Nukleokapsid (NC)-Proteins ab24 und führt durch Acetylierung der Cysteinseitenketten des NC-Proteins zum Ausstoß von Zink und zum Verlust der Virusinfektiosität25,26 . Wichtig ist, dass SAMT-247 einen intrazellulären Recyclingmechanismus aufweist, bei dem freigesetztes Thiol durch Acetyl-CoA erneut acetyliert wird, was zur Bildung einer reaktiven Thioesterverbindung führt und so zahlreiche Runden viruzider Aktivität ermöglicht27.

Die SAMT-Verbindungsklasse hat die HIV-Übertragung in vitro in zellbasierten Tests, in Explantatkulturen und in unterschiedlichem Maße bei transgenen Mäusen und Makaken verhindert28,29,30,31. In diesem Artikel haben wir untersucht, ob das SAMT-Mikrobizid die Wirksamkeit eines RV144-ähnlichen Impfstoffs bei Makaken und seine potenzielle Eignung für den Einsatz in Studien am Menschen erhöhen könnte, da bisher keine andere Impfstoffplattform beim Menschen klinisch wirksam war3,4,5,6 ,7,8,9,10,11,12.

Wir beobachteten eine erhebliche Synergie zwischen dem Mikrobizid und den manipulierten V1-deletierten Hüllimmunogenen, die von der DNA/ALVAC-Impfstoffplattform bereitgestellt werden15,16; Der kombinierte Ansatz reduzierte das Risiko einer SIV-Infektion bei weiblichen Makaken um mehr als 90 %. SAMT-247, ein Zinkfingerprotein-Inhibitor mit viruzider Wirkung, verstärkte unerwarteterweise auch die impfstoffinduzierten Schutzreaktionen, wahrscheinlich durch eine Erhöhung der Zinkverfügbarkeit. Wir schlagen vor, dass unsere präklinische Studie einen gangbaren Weg zur wirksamen Verhinderung der HIV-Übertragung bei Frauen aufzeigt.

Wir haben eine Studie an Makaken entworfen, um die Unterschiede zwischen Impfung allein oder Impfung plus SAMT-247-Behandlung zu untersuchen, basierend auf der reproduzierbaren Wirksamkeit des ΔV1DNA/ALVAC-SIV/ΔV1gp120/Alaun-Impfstoffs bei der Verringerung des Risikos einer SIVmac251-Akquisition um 60–70 % (Lit. 15,16). Wir haben die Impfung 38 weiblichen Makaken verabreicht. Fünf Wochen nach der letzten Immunisierung (Woche 17) wurden alle Tiere bis zu 14 wöchentlichen intravaginalen SIVmac251-Provokationen ausgesetzt. Vier Stunden vor jeder Belastungsexposition wurden 20 geimpfte Tiere vaginal mit 0,8 % SAMT-247 in Hydroxyethylcellulose (HEC)-Gel behandelt, die restlichen 18 Tiere nur mit HEC-Gel. Zwei weitere Gruppen nicht immunisierter Tiere (jeweils sechs) wurden 4 Stunden vor der Virusexposition als Kontrollen entweder mit SAMT-247/HEC-Gel oder HEC-Gel behandelt (Abb. 1a). Alle Tiere wurden einer Infektion ausgesetzt, bis die Infektion durch wiederholte Nanotröpfchen-PCRs dokumentiert wurde. Wir haben die Studie so konzipiert, dass sie SIV-Erfassungsdaten von 31 historischen Kontrollen (Online-Methoden) umfasst, die mit demselben Virusbestand in derselben Tierhaltung getestet wurden. Die Wirksamkeit des Impfstoffs (VE) wurde als Risiko einer SIV-Erkrankung pro Exposition gemessen. Wie erwartet wurde kein Unterschied im Risiko einer Virusinfektion zwischen gleichzeitigen und historischen Kontrollen beobachtet (Erweiterte Daten, Abb. 1a). Der Impfstoff allein verringerte das Risiko einer Virusinfektion signifikant (65 %) im Vergleich zu allen Kontrollen (P = 0,0074; Abb. 1b) sowie nur zu historischen Kontrollen (P = 0,0061; Erweiterte Daten, Abb. 1b), was mit früheren Studien übereinstimmt15. Darüber hinaus wurde ein Trend beobachtet, bei dem nur die sechs gleichzeitigen Kontrollen verwendet wurden (Extended Data, Abb. 1c). Bemerkenswerterweise führte die Kombination aus Impfstoff und SAMT-247 im Vergleich zu allen Kontrollen (P < 0,0001; Abb. 1c) sowie zu getrennten gleichzeitigen oder historischen Kontrollen (P = 0,0002 und P) zu einer Reduzierung des Risikos einer Virusinfektion um 92,7 % jeweils < 0,0001; Erweiterte Daten Abb. 1d, e). Die Kombination aus Impfstoff und SAMT-247 unterschied sich deutlich von der Gruppe mit nur Impfstoff (P ​​= 0,006; Abb. 1d) und schützte 16 von 20 Tieren (80 %) vor einer Infektion. Im Gegensatz dazu verringerte die alleinige Behandlung mit SAMT-247 das Risiko einer Virusinfektion im Vergleich zu kombinierten Kontrollen (Abb. 1e) oder den gleichzeitigen oder historischen Kontrollen separat (erweiterte Daten, Abb. 1f, g) nicht signifikant. Bei geimpften Tieren, die infiziert wurden, beobachteten wir 2 Wochen nach der Infektion unabhängig von der SAMT-247-Behandlung geringere Virus-RNA-Werte im Plasma, diese hielten jedoch nicht an (Abb. 1f).

a: Rhesusaffen wurden in vier Gruppen unterteilt: Impfstoff (n = 18), Impfstoff + SAMT-247 (n = 20), SAMT-247 (n = 6) und gleichzeitige und historische Kontrollen (n = 6 und 31). Achtunddreißig Tiere wurden zu den angegebenen Zeitpunkten mit ΔV1-DNA-SIVgp160+p57-Gag geprimt und mit ALVAC-SIV, das für env, gag und pol kodiert, und ALVAC-SIV + ΔV1-gp120-Protein in Alaunhydroxid geboostert. Zwölf Tiere blieben bis zur SIV-Provokation naiv. Ab Woche 17 wurde die Wirksamkeit des Impfstoffs (VE) bewertet, indem alle Tiere bis zur Bestätigung der Infektion bis zu 14 wöchentlichen intravaginalen Virusexpositionen (Pfeile) in Gegenwart oder Abwesenheit von SAMT-247 ausgesetzt wurden. Die Tiere erhielten 4 Stunden vor jeder niedrig dosierten SIVmac251-Exposition entweder 0,8 % SAMT-247 in HEC-Gel (n = 26) oder nur HEC-Gel (n = 24). b,c, Signifikanter Schutz in der Impfstoffgruppe (P = 0,0074) (b) und der Impfstoff + SAMT-247-Gruppe (P < 0,0001) (c) im Vergleich zu gleichzeitigen + historischen Kontrollen. d, Verzögerter SIV-Erwerb in der Gruppe mit Impfstoff + SAMT-247 im Vergleich zur Gruppe mit nur Impfstoff (P ​​= 0,006). e: Es wurden keine Unterschiede in der verzögerten Erfassung in der SAMT-247-Gruppe im Vergleich zu den kombinierten gleichzeitigen und historischen Kontrollen beobachtet (P = 0,27). f, geometrisches Mittel der Viruslast (VL) aller Makakengruppen im Zeitverlauf. Eine produktive Infektion wurde durch das Vorhandensein viraler DNA und RNA in der Schleimhaut und die Persistenz viraler RNA im Plasma über einen längeren Zeitraum qualifiziert. Die in b–e gezeigten Daten wurden mit dem Log-Rank-Test (Mantel-Cox) analysiert.

Quelldaten

Zu den Immunkorrelaten des verringerten Risikos, die durch die DNA/ALVAC/gp120/Alaun-Impfstoffplattform hervorgerufen werden, gehören systemische V2-spezifische ADCC16-Schleimhauthüllen-spezifische NKp44+-Zellen, die IL-17 produzieren (Lit. 13), CD14+-Monozyten, die Efferozytose15 vermitteln, und Th1/Th2-Zellen, die Nr. 1 exprimieren oder niedrige CCR5-Werte (Ref. 14,15,16). Wir haben die Immunkorrelate des Risikos getrennt in geimpften und geimpften + SAMT-247-behandelten Gruppen getestet.

Die Konzentrationen systemischer Antikörper gegen ΔV1gp120- und V2-Peptide, ADCC-Titer und V2-spezifisches ADCC, gemessen unter Verwendung eines kompetitiven Assays mit F(ab′)2, das aus den Anti-V2-mAbs NCI05 oder NCI09 erhalten wurde, unterschieden sich bei den geimpften SAMT-247 nicht -behandelte oder unbehandelte Gruppen, wie erwartet (Extended Data Abb. 2a–e). Überraschenderweise korrelierten die spezifische ADCC-Aktivität und die Titer am Ende der Immunisierung (Woche 17) signifikant mit einem verringerten Risiko einer SIVmac251-Akquisition in der Nur-Impfstoff-Gruppe (R = 0,67, P = 0,002 bzw. R = 0,60, P = 0,009; erweitert). Daten Abb. 2f,g), jedoch nicht in der Impfstoff+SAMT-247-Gruppe (Erweiterte Daten Abb. 2h,i). Dasselbe wurde für V2-spezifisches ADCC beobachtet, das durch NCI05 und NCI09 F(ab′)2 definiert ist (R = 0,75, P = 0,0003 bzw. R = 0,77, P = 0,0002; Erweiterte Daten Abb. 2j – m). Diese Ergebnisse ließen die Hypothese aufkommen, dass die Behandlung mit SAMT-247 die ADCC-Reaktionen der Schleimhaut in vivo zum Zeitpunkt der Virusexposition beeinflusst haben könnte.

Da keine Schleimhautproben von geimpften Tieren verfügbar waren, haben wir diese Hypothese getestet, indem wir menschliche PBMCs in vitro mit SAMT-247 als Effektorzellen behandelten, bevor wir die ADCC-Assays erstellten. Wir fanden heraus, dass die Behandlung mit SAMT-247 in vitro die durch Plasmaantikörper (Woche 17) von geimpften Tieren vermittelte ADCC-Aktivität signifikant steigerte (P < 0,0001; Abb. 2a). Der Unterschied in der ADCC-Aktivität in vitro, gemessen in Gegenwart oder Abwesenheit von SAMT-247, korrelierte mit einem verringerten Risiko einer Virusansteckung in vivo bei den geimpften + mit SAMT-247 behandelten Tieren (R = 0,50, P = 0,024; Abb. 2b). Da diese Daten darauf hindeuten, dass die topische Verabreichung von SAMT-247 möglicherweise die Effektorfunktion des natürlichen Killers (NK) der Schleimhaut verstärkt, haben wir getestet, ob SAMT-247 auch die NK-Funktion der Schleimhaut nach In-vitro-PMA (Phorbol-12-Myristat-13-Acetat)/Ionomycin-Stimulation beeinflusst . Der Einfachheit halber wird die PMA/Ionomycin-Stimulation in dieser Veröffentlichung als PMA-Stimulation bezeichnet. Wir fanden heraus, dass SAMT-247 die Expression von Granzym B und Perforin erhöhte (P = 0,02 für beide; Abb. 2c) und IFN-γ (P = 0,02) und TNF-α (nicht signifikant (NS)) in NKG2A+-Zellen der Makakenschleimhaut verringerte (Abb. 2d). Ein ähnlicher Effekt wurde auch bei menschlichen NK-Zellen aus Blut beobachtet (Extended Data Abb. 3a,b). Als nächstes maßen wir schleimhauthüllenspezifische NKp44+IL-17+-Zellen, ein weiteres Korrelat des verringerten Risikos einer Virusansteckung13,23, und stellten fest, dass sich ihre Häufigkeit in der 13. Woche zwischen den geimpften/SAMT-247-behandelten und unbehandelten Gruppen nicht unterschied , wie erwartet, da zu diesem Zeitpunkt noch kein SAMT-247 verabreicht worden war (Extended Data Abb. 3c). Interessanterweise korrelierte ihre Häufigkeit jedoch signifikant mit einem verringerten Risiko einer Virusansteckung in der nur geimpften Gruppe (R = 0,77, P = 0,0002; Extended Data Abb. 3d), was darauf hindeutet, dass diese Reaktion in der Schleimhaut möglicherweise durch SAMT moduliert wurde. 247 Behandlung. Wir haben diese Hypothese an mononukleären Schleimhautzellen getestet, die aus neun Makaken gleichen Alters isoliert wurden, indem wir sie in vitro mit PMA mit und ohne SAMT-247 vorbehandelten. Der Prozentsatz der NKp44+-Zellen, die nach PMA-Stimulation IL-17 produzieren, wurde durch SAMT-247 erhöht (P = 0,04; Abb. 2e und erweiterte Daten Abb. 3e, f), was die Hypothese stützt, dass die In-vivo-Schleimhautbehandlung mit SAMT-247 lokal zunimmt die Funktion von NKp44+-Zellen, wodurch die Schleimhautintegrität erhöht und die Wirksamkeit des Impfstoffs erhöht wird. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass SAMT-247 eine Synergie mit der Impfung hat, indem es die NKG2A-Funktion und ADCC sowie die schleimhautschützende NKp44+-Produktion von IL-17 steigert.

a, Vergleich der durch SAMT-247 unbehandelten/behandelten Effektorzell-vermittelten ADCC-Aktivität in der Impfstoff- (n = 18) und der Impfstoff + SAMT-247-Gruppe (n = 20; P < 0,0001). b, Korrelation der SAMT-247-induzierten ADCC-Aktivität mit der Anzahl intravaginaler Herausforderungen in der Impfstoff + SAMT-247-Gruppe (n = 20; P = 0,024). c,d, Intrazelluläres Granzym B, Perforin, IFN-γ und TNF-α in rektalen Schleimhautzellen von Makaken (n = 9) NKG2A+-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Reize. e, Makaken-NKp44+IL-17+-Zellen der rektalen Schleimhaut in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Reize (n = 9). f, Korrelation der Efferozytose mit der Anzahl intravaginaler Provokationen bei Tieren in der Impfstoffgruppe (n = 18; P = 0,01). g,h, Vergleich des Prozentsatzes der Efferozytose (P < 0,0001) (g) und des Efferozytose-MFI (P < 0,0001) (h) unter Verwendung von CD14+-Monozyten der Woche 14 bei allen geimpften Tieren (n = 38). i, Korrelation der SAMT-247-induzierten Efferozytose (SAMT-247-unbehandelte Efferozytose abgezogen von SAMT-247-behandelter Efferozytose) mit der Anzahl intravaginaler Herausforderungen in der Impfstoff + SAMT-247-Gruppe (n = 20; P = 0,065). Die in a, c, d, e, g und h gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test analysiert. Die in b, f und i gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Spearman-Korrelationstest analysiert. Horizontale und vertikale Balken geben den Mittelwert bzw. die Standardabweichung an.

Quelldaten

Die CD14+-Zell-assoziierte Efferozytose ist eine angeborene CD14+-Monozytenreaktion, die für die Beseitigung apoptotischer Zellen, die Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase und die Ausrottung von Krankheitserregern unerlässlich ist32. Die im Blut gemessene durch die Impfung induzierte CD14+-Zell-vermittelte Efferozytose korrelierte mit einem verringerten Risiko einer Virusansteckung in der nur geimpften Gruppe (R = 0,62; P = 0,01; Abb. 2f), wie in früheren Studien mit diesem Impfschema beobachtet15, aber nicht in der geimpften/SAMT-247-behandelten Gruppe (Extended Data Abb. 3g). Dies ließ die Hypothese aufkommen, dass SAMT-247 auch die Makrophagenfunktionalität an der Schleimhautstelle beeinflussen könnte. Wir führten daher einen Efferozytosetest mit den kryokonservierten ex vivo CD14+-Zellen durch, die aus dem Blut geimpfter Tiere (Woche 14) in Gegenwart und Abwesenheit von SAMT-247 gereinigt wurden, und stellten fest, dass SAMT-247 tatsächlich sowohl den Prozentsatz der CD14+-Zellen, die apoptotische Zellen verschlingen, erhöhte sowie die Menge an eingeschlossenen apoptotischen Zellen pro Zelle, gemessen als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) in CD14+-Zellen, die vor der (Vor-)Immunisierung (Extended Data Abb. 3h, i) und 2 Wochen (Woche 14) nach der letzten gesammelt wurden Immunisierung (P < 0,0001 für beide Zeitpunkte; Abb. 2g, h). Die impfstoffinduzierte Fähigkeit von CD14+-Zellen, apoptotische Zellen nach einer In-vitro-SAMT-247-Behandlung zu verschlingen, führte bei den in vivo mit SAMT-247 behandelten Tieren tendenziell zu einem verringerten Risiko einer Virusansteckung (R = 0,42, P = 0,065; Abb. 2i). .

Diese Daten stützen die Hypothese, dass SAMT-247 auf mehreren Ebenen mit impfstoffinduzierten Reaktionen zusammenwirkt: Erhöhung der zytotoxischen NKG2A+-Funktion und des V2-spezifischen schützenden ADCC sowie Verbesserung der Funktionalität schützender NKp44+-Zellen und CD14+-Zellen (wesentliche Reaktionen zur Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase und zur Eindämmung von Entzündungen). (Erweiterte Datentabelle 1a).

Durch den Impfstoff ausgelöste Darm-Homing-aktivierte α4β7+CD4+-T-Zellen, die den SIV/HIV-Korezeptor CCR5 (α4β7+CCR5+ CD4+-Zellen) exprimieren, wurden mit einem erhöhten Risiko einer Virusansteckung in Verbindung gebracht33,34. Hier fanden wir heraus, dass die Impfung mit dem ΔV1DNA/ALVAC/ΔV1gp120/Alaun-Regime die Häufigkeit des impfstoffinduzierten (Ki67+) α4β7+CCR5+-Gedächtnis-Th1 (CD4+α4β7+CCR5+CCR6−CXCR3+Ki67+CD95+) verringerte, und zwar in geringerem Maße Th2 (CD4+α4β7+CCR5+CCR6−CXCR3−Ki67+CD95+) Zellphänotypen (P < 0,0001 bzw. P = 0,01) und erhöhte die Häufigkeit von α4β7–CCR5–CD4+ Gedächtnis-Th1- und Th2-Zellen bei allen geimpften Makaken signifikant (P <0,0001 für beide; Erweiterte Daten Abb. 4a – e). Um die Auswirkung der Virusakquisition auf den Aktivierungsstatus von CD4+-T-Zellen zu beurteilen, stimulierten wir kryokonservierte Ex-vivo-PBMCs von geimpften Tieren (Woche 17) mit überlappenden Peptiden, die das gesamte gp120-Hüllprotein umfassen, um die Wirtsreaktion zum Zeitpunkt der Virusbegegnung in der Zelle zu simulieren Vorhandensein oder Fehlen von SAMT-247. SAMT-247 + gp120-Peptide verringerten die Häufigkeit von impfstoffinduzierten (Ki67+) α4β7+CCR5+ Th1- und Th2-Zellen (P = 0,04 bzw. P = 0,03; Abb. 3a, b) und erhöhten α4β7–CCR5– Th1- und Th2-Zellen (P = 0,008 bzw. P = 0,004; Abb. 3a, b). Bemerkenswerterweise korrelierte in Woche 17 der Prozentsatz sowohl der α4β7-CCR5-Th1- als auch der Th2-Zellen nach In-vitro-Stimulation mit gp120 und SAMT-247 signifikant mit der verzögerten Virusakquisition in vivo (R = 0,82, P = 0,012 und R = 0,76, P =). 0,020; Abb. 3c, d). Zum gleichen Zeitpunkt (Woche 17) untersuchten wir, ob SAMT-247 die Expression der T-Zell-Aktivierung/-Proliferation/-Erschöpfung auf Molekülen beeinflusst, die positiv und negativ mit Immunantworten assoziiert sind. Dazu gehörten die Rezeptoren/Ligandenmarker OX40, die auf aktivierten T-Zellen exprimiert werden35, der CD40-Ligand (CD154), der eine kurzfristige CD4+-T-Zell-Aktivierungsreaktion auslöst36, der Frühaktivierungsmarker CD69 (Ref. 37) und der Proliferationsmarker ki67 (Ref . 38). Wir untersuchten zusätzlich die negativen Regulatoren CTLA-4 und PD-1, die die T-Zell-Aktivierung hemmen39, den PD-L1/PD-1-Signalweg, der zur T-Zell-Erschöpfung beiträgt40, und den Erschöpfungsmarker Lag-3 (Lit. 41). ). SAMT-247 steigerte die gp120-Modulation keines dieser Moleküle (Extended Data Abb. 5 und 6).

a,b, Bewertung der CCR5- und α4β7-Marker auf Th1- und Th2-Zellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von Reizen in den Tieren der Impfstoff- + SAMT-247-Gruppe (n = 9). c,d, Korrelation von gp120-Peptid + SAMT-247 stimulierten CCR5−α4β7− Th1- (P = 0,012) und Th2-Zellen (P = 0,020) mit der Anzahl intravaginaler Herausforderungen in der Impfstoff + SAMT-247-Gruppe (n = 9). e,f, IFN-γ+, TNF-α+ und IL-10+ Th1- und Th2-Zellen in der Rektalschleimhaut in Abwesenheit oder Anwesenheit von Reizen (n = 9). Die in a, b, e und f gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test analysiert. Die in c und d gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Spearman-Korrelationstest analysiert. Horizontale und vertikale Balken geben den Mittelwert bzw. die Standardabweichung an.

Quelldaten

Als nächstes untersuchten wir die Wirkung der SAMT-247-Behandlung auf schleimige Th1- und Th2-Zellen altersentsprechender Makaken nach PMA-Stimulation. Während sich die Gesamthäufigkeit der mukosalen Th1- und Th2-Zellen bei der PMA-Stimulation nicht änderte (Extended Data Abb. 7a,b), war die Behandlung mit SAMT-247 mit einer signifikanten Abnahme der TNF-α-Produktion in Th2-Zellen und schwächer in Th1-Zellen verbunden ( P = 0,004 bzw. P = 0,04) sowie mit erhöhter IL-10-Produktion in Th1-Zellen (P = 0,04; Abb. 3e, f und erweiterte Datentabelle 1b).

Das oben beschriebene Spektrum der Auswirkungen von SAMT-247 auf die Funktionen von NK-Zellen, Monozyten und T-Zellen legt nahe, dass SAMT-247 eine zentrale Komponente der Immunität beeinflussen könnte. Da Zink ein Hauptregulator der Immunität ist42,43, stellten wir die Hypothese auf, dass SAMT-247 die impfstoffinduzierte Immunität verstärkt haben könnte, indem es Zink aus Proteinen ausstößt und seine Verteilung in Immunzellen beeinflusst. Wir verwendeten konfokale Mikroskopie, um zelluläres Zink in menschlichen NK-Zellen zu messen, die mit PMA mit oder ohne SAMT-247 in Gegenwart oder Abwesenheit eines Zinkchelators stimuliert wurden. Mit PMA + SAMT-247 behandelte Zellen zeigten im Vergleich zu nicht stimulierten Zellen eine deutlich hellere Zinkfärbung pro Zelle (P = 0,04) und einen Trend bei PMA-stimulierten Zellen (P = 0,08; Abb. 4a, b), der zu einer Abnahme tendierte Vorhandensein des Zinkchelators (P = 0,055; Abb. 4b).

a, Repräsentative Bildgebung menschlicher NKG2A+-Zellen, unstimuliert oder stimuliert mit SAMT-247, PMA oder PMA + SAMT-247. b, Mittlere Zinkintensität in NKG2A+-Zellen des gesunden menschlichen Spenders in Gegenwart oder Abwesenheit von Zink-Chelator unter verschiedenen Stimulationsbedingungen (n = 8). Die Fluoreszenzintensität jedes Feldes wurde für die Zinkexpression gemessen, angezeigt durch die grüne Farbe, und die Gesamtzahl der DAPI-positiven Zellen wurde gezählt, um die mittlere Intensität von Zink/Zellen mithilfe der iMARIS-Software zu bestimmen. Für die Berechnung wurde der Mittelwert zweier Duplikatfelder ausgewertet. c, Vergleich der Expression des NKG2A-Markers bei Makaken in Abwesenheit oder Anwesenheit von Zinkchelator und Stimuli in der Impfstoff + SAMT-247-Gruppe (n = 4) und der Impfstoffgruppe (n = 2). d–g, Vergleich der Expression von Granzym B, Perforin, IFN-γ und TNF-α durch Makakenblut-NKG2A+-Zellen ab Woche 17 in Abwesenheit oder Anwesenheit verschiedener Stimulationen und Zinkchelatbildner in der Impfstoff + SAMT-247-Gruppe (n = 4) und Impfgruppe (n = 2). h,i, Bewertung der Häufigkeit von CD14+-Monozyten und CD14+IL-10+-Monozyten in Abwesenheit oder Anwesenheit von Zinkchelator und Stimuli in der Impfstoff + SAMT-247-Gruppe (n = 4) und der Impfstoffgruppe (n = 2) . Die in b–i gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test analysiert. Horizontale und vertikale Balken geben den Mittelwert bzw. die Standardabweichung an.

Quelldaten

Als nächstes untersuchten wir den Beitrag von zweiwertigem freien Zink zu den schützenden Immunantworten mithilfe kryokonservierter Ex-vivo-PBMCs von geimpften Makaken (Woche 17). Um die Virusexposition nachzuahmen, stimulierten wir Zellen in vitro mit SIV-gp120-Hüllpeptiden in Gegenwart oder Abwesenheit von SAMT-247 und dem membrandurchlässigen intrazellulären Zinkchelatbildner N,N,N′,N′-Tetrakis-(2-pyridylmethyl). ) Ethylendiamin (TPEN). Die Zink-Chelatisierung hatte weder Einfluss auf das Überleben von SAMT-247-assoziiertem NKG2A+ noch auf deren Fähigkeit, Granzym B und Perforin nach gp120-Peptidstimulation zu erhöhen, was darauf hindeutet, dass diese SAMT-247-Aktivitäten nicht von Zink abhängig sind (Abb. 4c – e). Im Gegensatz dazu verringerte die TPEN-Behandlung sowohl die IFN-γ- als auch die TNF-α-Expression nach der gp120-Peptid- oder gp120-Peptid/SAMT-247-Stimulation signifikant, was darauf hindeutet, dass SAMT-247 durch das Ausstoßen von Zink die strukturelle Stabilität von Transkriptionsfaktoren für Zytokine beeinflussen kann Darüber hinaus verstärkt die TPEN-Behandlung diesen Effekt, indem sie Zink aus Proteinen entfernt und intrazelluläres zweiwertiges Zink bindet (Abb. 4f, g). Diese Hypothese wird durch ähnliche Ergebnisse gestützt, die mit menschlichen NKG2A+-Zellen erzielt wurden (Extended Data Abb. 7c – g).

Mehrere Monozytenfunktionen wie die Phagozytose von Monozyten und Makrophagen sind von Zink abhängig und können durch Nahrungsergänzungsmittel wiederhergestellt werden. Aktuelle Studien am Menschen zeigen auch, dass der intrazelluläre Zinkspiegel mit der Efferozytose korreliert, die ihrerseits durch auflösungsförderndes IL-10 über einen IL-10-vermittelten endokrinen Mechanismus induziert wird44,45,46. Wir untersuchten daher die Wirkung der Zink-Chelatbildung auf die SAMT-247-assoziierte CD14+-Zellfunktion, indem wir kryokonservierte Ex-vivo-CD14+-Zellen geimpfter Tiere (Vorimmunisierung und Woche 13) mit gp120-gepoolten Peptiden in Gegenwart oder Abwesenheit von SAMT-247 und TPEN stimulierten . Wir beobachteten einen erhöhten Prozentsatz an CD14+-Zellen nach der SAMT-247-Behandlung (P = 0,03; Abb. 4h), was auf ein erhöhtes Überleben dieser Zelluntergruppe in Gegenwart des Arzneimittels schließen lässt. Allerdings nahmen die Häufigkeit von CD14+-Zellen sowie ihre Fähigkeit, IL-10 zu produzieren, nach der TPEN-Behandlung stark ab (Abb. 4i). Diese Daten stimmen mit früheren Arbeiten überein, die zeigen, dass zweiwertiges Zink das Überleben und die Funktionalität von CD14+-Zellen erhöht47.

Abschließend untersuchten wir die Wirkung der Zink-Chelatbildung auf kryokonservierte ex vivo CCR5- und α4β7-positive oder -negative Th1 und Th2, die durch die Impfung hervorgerufen wurden (Woche 17). PBMCs wurden mit gp120-gepoolten Peptiden in Gegenwart oder Abwesenheit von SAMT-247 und TPEN stimuliert. Die Zinkchelatbildung führte unter allen Bedingungen zu einem dramatischen Rückgang der CCR5+ α4β7+ CD4+ Th1- und Th2-Untergruppen (Abb. 5a, b). TPEN verursachte einen signifikanten Rückgang des Prozentsatzes der Th1-negativen Zellen für die CCR5- und α4β7-Expression (P = 0,03 für alle Bedingungen; Abb. 5c), hatte jedoch keinen Einfluss auf den Prozentsatz der Th2-Zellen, die für die CCR5- und α4β7-Expression negativ waren (Abb. 5d). Die Expression von IFN-γ, TNF-α und IL-10 wurde durch die Zinkchelatbildung in Th1- und Th2-Zellen unter den meisten Stimulationsbedingungen erheblich beeinträchtigt, unabhängig von ihrer Expression von CCR5 und α4β7 (Abb. 5e – h und Extended Data Abb. 8). und 9). Die TNF-α-Expression in CCR5- und α4β7-negativen Th1 und Th2 war jedoch nicht im gleichen Ausmaß beeinträchtigt (Extended Data Abb. 8 und 9).

a–d, Vergleich der Expression von CCR5- und α4β7-Markern in Th1- und Th2-Gedächtniszellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von Zinkchelator und Stimuli in der Impfstoff+SAMT-247-Gruppe (n = 4) und der Impfstoffgruppe (n = 2). e–h, Radardiagramme zum Vergleich unterschiedlicher Expressionen von Zytokinen durch verschiedene Untergruppen von Th1- und Th2-Zellen geimpfter Tiere in Woche 17 in Abwesenheit oder Anwesenheit von Stimulation und Zink-Chelator (n = 6). Die in a–h gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test analysiert. Horizontale und vertikale Balken geben den Mittelwert und die Standardabweichung an. Das Radardiagramm stellt den mittleren prozentualen Wert der Zytokinreaktionen dar. Durchgezogene Linien stellen das Fehlen von Zinkchelatbildner dar und gestrichelte Linien stellen das Vorhandensein von Zinkchelatbildner dar.

Quelldaten

Zusammengenommen belegen diese Daten eine unterschiedliche Anfälligkeit von Th1 und Th2 gegenüber SAMT-247 und eine unterschiedliche Abhängigkeit von Zink. SAMT-247 erhöht in Gegenwart des gp120-Peptids die Lebensfähigkeit von Th2, das für die CCR5- und α4β7-Expression negativ ist, und erhöht die Expression von IL-10 in allen Th1- und Th2-Untergruppen, wodurch wahrscheinlich eine entzündungshemmende Umgebung entsteht. Die Produktion von IL-10 wird durch die Chelatisierung von Zink gehemmt; Die IFN-γ-Produktion hängt in allen Th1- und Th2-Zelluntergruppen stark von Zink ab, wohingegen die durch SAMT-247 vermittelte Abnahme der TNF-α-Expression weniger zinkabhängig zu sein scheint (erweiterte Datentabelle 1c).

In dieser präklinischen Makakenstudie untersuchten wir, ob die topische Verabreichung des gelformulierten S-Acyl-2-Mercaptobenzamidthioesters SAMT-247, der die Reifung und Infektiosität von HIV in vitro48,49 hemmt, synergetisch mit der DNA/ALVAC/gp120/Alaun-Impfung wirkt. Wie bereits berichtet15,16 verringerte die Impfung allein das Risiko einer SIVmac251-Akquisition um 65 %, und die alleinige Behandlung mit SAMT-247, verabreicht 4 Stunden vor der Belastungsexposition, hatte keine Wirkung. Die topische SAMT-247-Behandlung geimpfter Frauen führte jedoch zu einer bemerkenswerten Verringerung des Risikos einer SIVmac251-Akquisition pro Exposition um 92,7 %, was auf zusätzliche Wirkungen von SAMT-247 neben seiner viruziden Aktivität schließen lässt. Wir stellten die Hypothese auf, dass SAMT-247 die Immunität beeinflusst. Unter Verwendung von Plasma bzw. ex vivo kryokonservierten Zellen von geimpften Tieren haben wir in vitro gezeigt, dass SAMT-247 die NKG2A-vermittelte ADCC, die Monozyten-Efferozytose und die IL-10-Produktion steigert.

Bemerkenswerterweise verringerte die Behandlung mit SAMT-247 in vitro auch die Expression von IFN-γ, dem proinflammatorischen Zytokin TNF-α und die CCR5-Expression in ex vivo kryokonservierten T-Zellen von geimpften Tieren, wodurch die Zielzellen für eine SIV-Infektion verringert wurden. Schließlich haben wir gezeigt, dass die In-vitro-Behandlung von rektalen Schleimhautzellen von Makaken die Häufigkeit von mukosalen IL-17-produzierenden NKp44-Zellen erhöhte. Es wurde gezeigt, dass alle diese Immunreaktionen reproduzierbar mit einem verringerten Risiko einer Virusansteckung bei geimpften Tieren korrelieren13,14,15,16,23. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Fähigkeit von SAMT-247, Zink aus Transkriptionsfaktoren oder Enzymen auszuschleusen, eine zinkvermittelte, durch Impfstoffe induzierte Immunität und Schutz ermöglichen könnte.

Zink ist ein essentieller Mikronährstoff und ein struktureller Bestandteil von etwa 800 Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren50 und 2.000 Enzymen51. Seine Rolle bei der Immunität ist gut bekannt42,43,52,53. Relevant für den hier getesteten Impfstoffansatz ist, dass Zink und Zinktransporter eine Rolle bei der Efferozytose spielen46 und eine Zinkergänzung die phagozytische Funktion von Granulozyten und Monozyten steigert54. Die intrazelluläre Mobilisierung von Zink wird durch die Aktivierung des c-AMP-Signalwegs in menschlichen Krankheitserregern ausgelöst55, und bei Mäusen, denen eine Diät mit Zinkmangel verabreicht wurde, wurde eine Funktionsstörung der Th2-Reaktionen im Zusammenhang mit einer fehlerhaften Umprogrammierung von Monozyten zu entzündungshemmenden M2-Makrophagen nachgewiesen56. Tatsächlich fanden wir heraus, dass die In-vitro-Chelatisierung von Zink durch TPEN die SAMT-247-Modulation der IFN-γ-, TNF-α- und CCR5-Expression in stimulierten T-Zellen sowie IL-10 in Monozyten beeinflusste. Im Gegensatz dazu hatte die Zinkchelatbildung keinen Einfluss auf den SAMT-247-assoziierten Anstieg von Perforin und Granzym in NK-Zellen (erweiterte Datentabelle 1c). Daher kommen wir zu dem Schluss, dass SAMT-247 synergistisch mit dem DNA/ALVAC/gp120/Alaun-Impfstoffschema als Immunverstärker wirkt, indem es die immunologische Funktion von Effektorzellen steigert (Abb. 6).

Impfinduziertes ADCC führt zur Apoptose von SIV-infizierten Zellen, die wiederum von Efferozyten beseitigt werden, um Entzündungen zu vermeiden und die Gewebehomöostase aufrechtzuerhalten. Die durch den Impfstoff induzierte IL-10-Expression in CD14+-Monozyten steigert die Efferozytose weiter. Impfinduzierte NKp44+-Zellen produzieren das Zytokin IL-17, das die Integrität des Schleimhautepithels aufrechterhält. Alle diese schützenden Effektorreaktionen wurden in der Gruppe mit Impfstoff + SAMT-247 dramatisch verstärkt, was den Schutz vor der Übernahme von SIVmac251 erhöhte. Das Schema ist von Bissa et al.15 übernommen.

Wir können jedoch einen möglichen Beitrag der antiviralen Wirkung von SAMT-247 zur Verringerung der Virusinfektiosität in der Vaginalschleimhaut nicht ausschließen. In unserer Studie haben wir bei naiven Tieren keinen Effekt auf die Virusakquise durch SAMT-247 allein beobachtet, allerdings muss beachtet werden, dass die zuvor im SIVmac251-Modell berichtete Schutzwirkung von SAMT-247 allein bei Tieren erzielt wurde, die scheinimmunisiert wurden leerer Ad-Vektor und, relevant für das Alaun-Adjuvans31, ein wichtiger Faktor für die immunologische Landschaft, die durch den DNA/ALVAC/gp120/Alaun-Impfstoff geschaffen wird.

Zusammenfassend liefern wir Beweise dafür, dass eine Kombination aus dem V1-deletierten Hüllvirus-ähnlichen Partikel, das mit der DNA/ALVAC/gp120/Alaun-Impfstoffplattform verabreicht wird, und SAMT-247 bei der Vorbeugung von Vaginalinfektionen durch ein neutralisierungsresistentes, hochgradig wirksames Mittel ist pathogenes Virus. Unsere Daten deuten auch darauf hin, dass ADCC und Efferozytose echte Auslöser des Schutzes gegen SIV/HIV sein könnten, was auf eine unterschätzte Rolle von Monozyten und NK-Zellen bei der Wirksamkeit des Impfstoffs hinweist. Schließlich unterstreichen unsere Daten die Bedeutung von entzündungshemmenden Reaktionen, die eine niedrige T-Zell-Aktivierung aufrechterhalten und so vor der Ansteckung mit SIV/HIV schützen können.

Diese Forschung entspricht allen relevanten ethischen Vorschriften. Das NCI Animal Care and Use Committee (ACUC) genehmigte die Impfstoffstudie. Neun weitere Tiergewebe wurden aus unserer gemeinsamen Studie mit der Tulane-Tieranlage gewonnen und die Studie wurde vom Tulane ACUC genehmigt. Menschliche PBMCs wurden von acht gesunden Spendern über ein vom institutionellen Prüfgremium genehmigtes Protokoll der National Institutes of Health (NIH) gewonnen.

In dieser Studie wurden fünfzig weibliche indische Rhesusaffen aus der Freiland-Brutkolonie auf Morgan Island, South Carolina, verwendet. Die Makaken, die zu Beginn der Studie 2–3 Jahre alt waren, waren negativ für SIV, Affen-Retrovirus und Simian-T-Zell-Leukämie-Virus (STLV) und wurden für Mamu A*01, Mamu B*17 und Mamu B*08 MHC-typisiert. Die Makaken wurden vom Statistiker auf der Grundlage von Alter, Gewicht und Haplotyp randomisiert, bevor sie in vier Gruppen eingeteilt wurden: Impfstoff-/Mikrobizidgruppe (20 Makaken, 3 A*01-positiv, 1 B*17-positiv und 1 B*08-positiv); Nur-Impfstoff-Gruppe (18 Makaken, 3 A*01-positiv und 1 B*17-positiv); Nur-Mikrobizid-Gruppe (6 Makaken, 1 A*01-positiv und B*17-positiv) und Kontrollgruppe (6 Makaken, 1 A*01-positiv und B*17-positiv). Diese Gruppengrößen wurden auf der Grundlage einer früheren Impfstoffstudie ermittelt, in der 14 geimpfte Makaken und 18 Kontrolltiere verglichen wurden15,16, und auf einem Pilotexperiment, in dem wir einen Zeitraum zwischen der Mikrobizidverabreichung und der viralen Belastung definierten, der die Wirksamkeit des Mikrobizids verringern würde, sodass wir dies erreichen konnten beobachten einen additiven/synergistischen Effekt31. Wir haben ein 4-stündiges „Fenster“ zwischen der Verabreichung des Mikrobizids und der viralen Belastung gewählt, da sich dieser Zeitrahmen mit SAMT-247 allein als unwirksam erwiesen hat31. In der statistischen Analyse wurden auch die historischen Kontrollmakaken und Mikrobizid-Makaken verwendet. Es wurde angenommen, dass die Infektionsraten denen der zuvor beobachteten Nur-Gel- und Mikrobizid-Gruppen (0,333 bzw. 0,133) und der Impfstoff- und Kombinationsgruppen (0,120 bzw. 0,040) entsprechen. Es wurde erwartet, dass die Behandlungswirksamkeit der letzten drei Gruppen im Vergleich zur Nur-Gel-Gruppe 60 % (Mikrobizid), 64 % (Impfstoff) und 88 % (Kombination) betrug. Wenn den Tieren bis zu 14 Virusprovokationen verabreicht wurden und die Anzahl der Provokationen zur Infektion der Tiere mit dem Wald-Test des Proportional-Hazards-Modells verglichen wurde, wobei alle vier Gruppen gemeinsam analysiert wurden, lag die Teststärke auf dem zweiseitigen 0,05-Niveau Es wurde erwartet, dass der Unterschied zwischen der Impfstoffgruppe und der Kombinationsgruppe 79 % beträgt, während die Vergleiche dieser beiden Gruppen einzeln mit der Kontrollgruppe eine Aussagekraft von 82 % bzw. 99 % aufweisen würden. Der Test der Mikrobizidgruppe gegenüber der Kombinationsgruppe hätte eine Aussagekraft von 63 %. Der Kontrollgruppe wurden Daten von 31 historischen, naiven Kontrollpersonen hinzugefügt, die intravaginal mit der gleichen Dosis und Charge von SIVmac251 provoziert wurden, um die statistische Aussagekraft zu erhöhen. Es gab keinen Unterschied zwischen den gleichzeitigen und historischen Kontrollen hinsichtlich der SIV-Erwerbsrate (P = 0,74). Makaken wurden in der NCI Animal Facility am NIH, Bethesda, MD, untergebracht und gepflegt. Alle Tiere wurden gemäß den Standards der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung (OLAW, Animal Welfare Assurance A4149-01 für NIH) behandelt. Sämtliche Tierpflege und -verfahren wurden gemäß den vom NCI ACUC vor Beginn der Studie genehmigten Protokollen durchgeführt. Die Tiere wurden täglich engmaschig auf Anzeichen einer Krankheit überwacht und bei Bedarf wurde für angemessene medizinische Versorgung gesorgt. Die Tiere wurden gemäß dem genehmigten ACUC-Protokoll und der sozialen Verträglichkeit sozial gehalten, außer während der Virus-Challenge-Phase, in der sie einzeln gehalten wurden. Alle klinischen Verfahren, einschließlich der Biopsieentnahme, der Verabreichung von Anästhetika und Analgetika sowie der Euthanasie, wurden unter der Leitung eines Labortierarztes durchgeführt. Es wurden Maßnahmen ergriffen, um das Wohlergehen der Tiere sicherzustellen und die Beschwerden aller in dieser Studie verwendeten Tiere zu minimieren. Die Tiere wurden täglich mit frischem Futter aus Primatenkeksen, Obst, Erdnüssen und anderen Nahrungsmitteln gefüttert, um ihr Körpergewicht oder normales Wachstum aufrechtzuerhalten. Die Tiere wurden hinsichtlich ihres psychischen Wohlbefindens überwacht und mit körperlicher Bereicherung versorgt, einschließlich desinfiziertem Spielzeug, zerstörbarer Bereicherung (Karton und andere Papierprodukte) sowie akustischer und visueller Stimulation.

Zusätzlich wurde für eine In-vitro-Studie Rektalgewebe von neun zufällig ausgewählten weiblichen Rhesusaffen im Alter von 2–3 Jahren verwendet. Zu den altersentsprechenden Makaken aus dieser separaten Studie gehörten vier gegen HIV geimpfte Tiere und fünf unbehandelte Tiere, die alle mit Simian-Human-Immundefizienzviren (SHIV) infiziert waren. Für die Analyse dieser Studie wurde nach der Exposition von sieben infizierten und zwei nicht infizierten Tieren Rektalgewebe gewonnen. Aus dieser Sammlung standen zusätzliche Zellen zur Verfügung, die hier für die In-vitro-Studie verwendet wurden. Makaken wurden in der Tierstation der Tulane University untergebracht und gepflegt. Die neun Tiere wurden gemäß den Standards der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung (OLAW, Animal Welfare Assurance) behandelt. Die Pflege der neun Tiere und alle Eingriffe erfolgten nach vom Tulane ACUC genehmigten Protokollen.

Menschliche PBMCs wurden von acht gesunden Spendern nach einem vom NIH-Protokoll (99-CC-0168) genehmigten institutionellen Prüfgremium gewonnen. Forschungsblutspender legten eine schriftliche Einverständniserklärung vor und die Blutproben wurden vor der Verteilung anonymisiert. Nummer der klinischen Studie: NCT00001846.

Makaken in der Impfstoff/Mikrobizid-Gruppe und der reinen Impfstoffgruppe wurden in den Wochen 0 und 4 mit DNA immunisiert, die für SIVgp160ΔV1 (2 mg pro Dosis) und SIV239gag (1 mg pro Dosis) in einem Gesamtvolumen von 1 ml PBS kodiert. Die DNA wurde in beide Oberschenkel verabreicht (jeweils 0,5 ml). Nach 8 Wochen wurde den Makaken ALVAC, das für gag/pro/env (Wildtyp-env) kodiert, in den rechten Oberschenkel verabreicht, 108 pfu pro Dosis in 1 ml PBS. In Woche 12 wurden die Makaken mit dem gleichen ALVAC plus SIVgp120ΔV1-Protein (400 µg pro Dosis in 500 µl PBS plus 500 µl 2 % Alhydrogel) geboostert. Das ALVAC wurde am rechten Oberschenkel verabreicht; Die 1-ml-Dosis Env-Protein plus Alaun wurde dem linken Oberschenkel verabreicht. Ab Woche 17 wurden alle Makaken wöchentlich intravaginal mit 1 ml einer SIVmac251-Stammlösung mit 4000 TCID50/ml (bewertet in Rhesus-221-Zellen) provoziert. Es wurden bis zu 14 Herausforderungen durchgeführt, bis die Makaken SIV-positiv wurden, wie durch digitale Tröpfchen-PCR festgestellt wurde (HK Chung, J. Narola, H. Babbar, M. Naseri, N. Richardson, R. Pal und T. Fouts, Manuskript in Vorbereitung). . Dosen von 2 ml des Mikrobizids SAMT-247 wurden Makaken in der Impfstoff/Mikrobizid-Gruppe und der Mikrobizid-nur-Gruppe 4 Stunden vor jeder SIV-Provokation als Gel intravaginal verabreicht. Das 2-ml-Gel enthielt 0,8 % SAMT-247 in HEC-Gel (2,7 % Natrosol-Cellulose 250HX Pharma, 0,01 % DMSO und 0,9 % Kochsalzlösung). Makaken in der Nur-Impfstoff-Gruppe und der Kontrollgruppe erhielten HEC-Gel, dem nur SAMT-247 fehlte. Rhesusaffen wurden geimpft und Proben wurden während des Impfzeitraums sowie nach vaginaler Exposition der Tiere gegenüber SIVmac251 gesammelt. Dasselbe Material kann nicht mehrmals vom selben Affen gewonnen werden, was diese biologischen Exemplare einzigartig macht.

Die gesamten gp120-IgG-Antikörper wurden mittels ELISA gemessen. ELISA-Platten (Nunc Maxisorp 96-Well-Platte) wurden mit 100 μl 500 ng ml-1 SIVmac251-M766 gp120-Protein pro Well in 50 mM Natriumbicarbonatpuffer, pH 9,6, beschichtet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 200 μl PBS Superblock (Thermo Fisher Scientific) blockiert. Plasmaproben wurden mit Probenverdünnungsmittel (Avioq) seriell verdünnt und 100 μl verdünntes Plasma in die Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden abgedeckt und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, sechsmal mit PBS Tween 20 (0,05 %) gewaschen und mit 100 μl Anti-Human-HRP, verdünnt im Verhältnis 1:120.000 in Probenverdünnungsmittel (Avioq), 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert 37 °C. Die Platten wurden sechsmal gewaschen. Die Platten wurden unter Verwendung von 100 μl wässrigem K-Blue-Substrat (Neogen) in alle Vertiefungen entwickelt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 μl 2 N Schwefelsäure in alle Vertiefungen gestoppt und die Platte wurde bei 450 nm auf einem E-max-Plattenlesegerät von Molecular Devices abgelesen.

Plasmaproben wurden durch PEPSCAN-Analyse unter Verwendung der linearen Peptide SIVmac251 gp12016 untersucht. ELISA-Platten (Nunc Maxisorp) wurden mit 100 ng jedes der 1–89 überlappenden Peptide (wobei jeweils 15 Aminosäuren die gesamte SIVmac251-gp120-Sequenz umfassten) in 50 mM NaHCO3, pH 9,6, pro Vertiefung beschichtet und über Nacht bei 4 °C inkubiert , und mit 200 μl Pierce SuperBlock-Blockierungspuffer in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Serumproben wurden im Verhältnis 1:50 in Probenverdünnungsmittel (Avioq) verdünnt, 100 μl auf die Platte gegeben und 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Platten wurden sechsmal mit PBS Tween 20 (0,05 %) gewaschen und mit 100 μl Anti-Human-HRP, verdünnt im Verhältnis 1:120.000 in Probenverdünnungsmittel (Avioq), in alle Vertiefungen inkubiert und abgedeckt 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Platten wurden erneut sechsmal gewaschen und unter Verwendung von 100 μl wässrigem K-Blue-Substrat (Neogen) in alle Vertiefungen entwickelt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl 2 N Schwefelsäure zu allen Vertiefungen gestoppt und die Platte bei 450 nm auf einem E-max-Plattenlesegerät von Molecular Devices abgelesen.

Die Häufigkeit und Zytokinspiegel von NK/ILCs wurden in der rektalen Schleimhaut von Makaken vor der Impfung und eine Woche nach der letzten Impfung (Woche 13) gemessen. Frisch entnommene Rektalbiopsien wurden mit Kollagenase (2 mg ml−1; Sigma-Aldrich) in Abwesenheit von FBS 1 Stunde lang bei 37 °C behandelt und dann mithilfe einer 10-ml-Spritze mit einer Kanüle mit stumpfem Kopf mechanisch getrennt. Die Biopsien wurden mit R10 gewaschen und durch ein 70-μm-Zellsieb gegeben. Einzelne Zellen wurden gezählt und für das Experiment verwendet23. Ein Teil der Zellen wurde phänotypisiert und der Rest wurde in R10 in Gegenwart/oder Abwesenheit von gp120-Peptiden oder PMA (Phorbol-12-Myristat-13-Acetat)-Ionomycin 12 Stunden lang kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit Live/Dead Aqua Dye (Kat.-Nr. L34966, 0,5 μl) von Thermo Fisher gefärbt, gefolgt von einer Oberflächenfärbung mit Folgendem: Alexa 700 Anti-CD3 (SP34-2; Kat.-Nr. 557917, 5). μl), Alexa 700 Anti-CD20 (2H7; Kat.-Nr. 560631, 5 μl), Alexa 700 Anti-CD11b (ICRF44; Kat.-Nr. 557918, 5 μl), APC-Cy7 Anti-CD16 (3G8; Kat.-Nr. 557758, 5 μl), PE-CF594 Anti-CD56 (B159; Kat.-Nr. 562289, 5 μl), BV650 Anti-NKp44 (P44-8; Kat.-Nr. 744302, 5 μl), BV786 Anti-CD45 ( D058-1283; Kat.-Nr. 563861, 5 μl) von BD Biosciences; und PE-Cy7 anti-NKG2A (Z199; Kat.-Nr. B10246, 5 μl) von Beckman Coulter für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend erfolgte die Permeabilisierung mit einem FOXP3-Transkriptionspufferset (Kat.-Nr. 00−5523-00) von eBioscience gemäß Herstellerempfehlung und anschließende intrazelluläre Färbung mit: BV421 anti-IFN-γ (B27; Kat.-Nr . 562988, 5 μl) von BD Biosciences und PE-Cy5.5 anti-IL-17 (BL168; Kat.-Nr. 512314, 5 μl) von BioLegend für 30 min bei Raumtemperatur. Die Proben wurden mit einem BD FACSymphony A5-Zytometer erfasst und mit der FlowJo-Software 10.6 analysiert. NKG2A+ NK-Zellen wurden als Singuletts, lebende Zellen, CD45+-Zellen, CD3–, CD20–, CD11b– und NKG2A+ NKp44–-Zellen erfasst. NKp44+-Zellen wurden als Singuletts, lebende Zellen, CD45+-Zellen, CD3−, CD20−, CD11b− und NKG2A− NKp44+-Zellen erfasst. NKG2A− NKp44−-Zellen wurden als Singuletts, lebende Zellen, CD45+-Zellen, CD3−, CD20−, CD11b− und NKG2A− NKp44−-Zellen untersucht. Zytokine wurden gezielt auf die Elternpopulation übertragen.

Die Konzentrationen der CD4+-T-Zell-Untergruppen wurden im Blut zu Studienbeginn und in Woche 13 bei geimpften Tieren gemessen. PBMCs wurden mit Folgendem gefärbt: LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain (Kat.-Nr. L23105, Thermo Fisher); Alexa 700 Anti-CD3 (SP34-2; Kat.-Nr. 557917, 5 μl), BV785 Anti-CD4 (L200; Kat.-Nr. 563914, 5 μl), PeCy5 Anti-CD95 (DX2; Kat.-Nr. 559773, 5 μl), BV650 Anti-CCR5 (3A9; Kat.-Nr. 564999, 5 μl), BUV496 Anti-CD8 (RPA-T8; Kat.-Nr. 564804, 5 μl), BUV737 Anti-CD28 (CD28.2; Kat.-Nr . Nr. 612815, 5 μl) und FITC anti-Ki67 (B56; Kat. Nr. 556026, 5 μl) von BD Biosciences; APC Cy7 Anti-CXCR3 (G025H7; Kat.-Nr. 353722, 5 μl), BV605 Anti-CCR6 (G034E3; Kat.-Nr. 353420, 5 μl), BV510 Anti-CD127 (A019D5; Kat.-Nr. 351332, 5 μl ), BV750 Anti-PD-1 (EH12.2H7; Kat.-Nr. 329965, 5 μl) und BV711 Anti-CD25 (BC96; Kat.-Nr. 302636, 5 μl) von BioLegend; PE-eFluor 610 anti-CXCR5 (MU5UBEE; Kat.-Nr. 61-9185-42, 5 μl), eFluor 450 anti-FoxP3 (236A/E7; Kat.-Nr. 48-4777-42, 5 μl) von eBioscience; und APC anti-α4β7, bereitgestellt von der NIH Nonhuman Primate Reagent Resource (R24 OD010976 und NIAID-Vertrag HHSN272201300031C). Die Proben wurden mit einem BD FACSymphony A5-Zytometer erfasst und mit der FlowJo-Software 10.6 analysiert. Das Gating erfolgte an lebenden CD3+CD4+-Zellen und an impfstoffinduzierten Ki67+-Zellen. Die CXCR3- und CCR6-Expression wurde zur Identifizierung von Th1- oder Th2-Populationen verwendet14.

Die ADCC-Aktivität wurde unter Verwendung von EGFP-CEM-NKr-CCR5-SNAP-Zellen, die GFP konstitutiv exprimieren, als Ziele bewertet23,57. Kurz gesagt, eine Million Zielzellen wurden 2 Stunden lang bei 37 ° C mit 50 μg ΔV1-gp120-Protein inkubiert. Nach dieser Beschichtung wurden die Zielzellen gewaschen und mit SNAP-Surface Alexa Fluor 647 (New England Biolabs) gemäß den Empfehlungen des Herstellers 30 Minuten lang bei Raumtemperatur markiert. Plasmaproben, die 30 Minuten lang bei 56 ° C hitzeinaktiviert wurden, wurden seriell verdünnt (sieben zehnfache Verdünnungen, beginnend bei 1:10), und 100 μl wurden in die Vertiefungen einer V-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen (Millipore Sigma) gegeben. Insgesamt wurden 5.000 Zielzellen (50 μl) und 250.000 menschliche PBMCs (50 μl) als Effektoren in jede Vertiefung gegeben, um ein Effektor/Ziel-Verhältnis (E/T) von 50:1 zu ergeben. Die Platte wurde 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, gefolgt von zwei PBS-Waschvorgängen. Die Zellen wurden in 200 μl einer 2% igen PBS-Paraformaldehyd-Lösung resuspendiert und auf einem Symphony aufgenommen, der mit einem Hochdurchsatzsystem (BD Biosciences) ausgestattet war. Die spezifische ADCC-Aktivität wurde durch den Verlust von GFP aus den SNAP-Surface Alexa647+-Zielzellen gemessen. Als Hintergrund dienten Ziel- und Effektorzellen, die in Gegenwart von R10-Medium kultiviert wurden. Als Positivkontrolle wurde der monoklonale Anti-SIVmac gp120-Antikörper KK17 (NIH AIDS Reagent Program) verwendet. Die normalisierte ADCC-Aktivität wurde wie folgt berechnet: (ADCC-Aktivität in Gegenwart von Plasma – Hintergrund)/(ADCC-Aktivität in Gegenwart von KK17 – Hintergrund) × 100. Die Normalisierung wurde durchgeführt, um Platte-zu-Platte und Experiment-zu-Experiment zu minimieren Variation des Assays. Der ADCC-Endpunkttiter ist definiert als die reziproke Verdünnung, bei der die prozentuale ADCC-Aktivität größer war als die mittlere prozentuale ADCC-Aktivität der Hintergrundvertiefungen, die nur Medium mit Ziel- und Effektorzellen enthielten, plus drei Standardabweichungen.

F(ab′)2-Fragmente wurden sowohl aus NCI05- als auch aus NCI09-mAb hergestellt, da diese Antikörper überlappende konformativ unterschiedliche V2-Epitope16 erkennen. Dabei wurde das Pierce F(ab′)2-Mikrovorbereitungskit (Kat.-Nr. 44688, Thermo Fisher) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet Anweisungen. Ein SDS-PAGE-Gel mit dem gewonnenen F(ab′)2 wurde laufen gelassen und gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Silber gefärbt (Kat.-Nr. LC6070, Silver Quest Staining Kit, Invitrogen), um die Reinheit des F(ab′)2 sicherzustellen. 2 Fragmente. Zielzellen, die wie oben angegeben mit ΔV1 gp120-Protein beschichtet und mit SNAP-Surface Alexa Fluor 647 markiert waren, wurden 1 Stunde lang bei 37 °C mit 5 μg ml−1 gereinigten F(ab′)2-Fragmenten von NCI05 oder NCI09 inkubiert monoklonale Antikörper. Als Kontrolle dienten Zellen, die ohne F(ab′)2 inkubiert wurden. Diese Zielzellen wurden anschließend wie oben beschrieben im ADCC-Assay verwendet. Diese F(ab′)2 hemmen die Bindung (und ADCC), die durch die Anti-V2-Antikörper aus dem Plasma immunisierter Tiere vermittelt wird. Der prozentuale ADCC-Aktivitätsunterschied in Gegenwart oder Abwesenheit von F(ab′)2 wird als V2-spezifische ADCC-Aktivität betrachtet.

Zehn Millionen menschliche PBMC-Effektorzellen wurden in 1 ml R10-Medium resuspendiert und in Gegenwart/Abwesenheit von 100 μM SAMT-247 4 Stunden lang inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und als Effektorzellen verwendet, um die ADCC-Aktivität wie oben beschrieben zu messen. SAMT-247-induziertes ADCC wurde gemessen, indem ADCC ohne SAMT-247-behandelte Effektorzellen von ADCC mit SAMT-247-behandelten Effektorzellen abgezogen wurde.

Die Häufigkeit efferozytotischer CD14+-Zellen wurde mit dem Efferozytose-Assay-Kit (Kat.-Nr. 601770, Cayman Chemical Company) bestimmt. Als Effektorzellen wurden CD14+-Zellen verwendet, während als Zielzellen apoptotische Neutrophile verwendet wurden. Das Protokoll wurde aufgrund der geringen Zellverfügbarkeit neu angepasst, um CD14+-Monozytenzellen statt differenzierter Makrophagen zu verwenden15. CD14+-Zellen wurden aus kryokonservierten PBMCs (10 × 106 Zellen) isoliert, die nach der Vorstudie und zwei Wochen nach der letzten Immunisierung (Woche 14) unter Verwendung nichtmenschlicher Primaten-CD14-MicroBeads (Nr. 130-091-097, Miltenyi Biotec) gemäß den Anweisungen des Herstellers gesammelt wurden . Am Ende der Trennung wurden die Zellen gezählt und mit CytoTell Blue (AAT Bioquest) gefärbt, das im Kit enthalten war und den Anweisungen des Herstellers folgte. Als Quelle für Neutrophile als Zielzellen wurde ein nicht verwandter Makaken verwendet. Neutrophile wurden von Ficoll Plaque (GE Healthcare) aus PBMCs isoliert, das Zellpellet wurde zu einem gleichen Volumen von 20 % Dextran in Wasser gegeben, vorsichtig gemischt und 1 Minute lang inkubiert. Ungefähr drei Volumina PBS wurden hinzugefügt, erneut gemischt und 50–60 Minuten im Dunkeln inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde die klare Schicht an der Oberseite des Röhrchens, die Neutrophile enthielt, gesammelt. Die Zellen wurden pelletiert und 5 Minuten lang bei 37 ° C mit ACK-Lysepuffer (Quality Biological) behandelt, mit R10 gewaschen und gezählt. Neutrophile wurden mit dem im Kit enthaltenen CFSE gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt. Die Apoptose von Neutrophilen wurde durch die Behandlung mit dem im Kit enthaltenen Staurosporin-Apoptose-Induktor induziert. Kurz gesagt, isolierte Zellen wurden in R10, das 1:1.000 verdünntes Staurosporin enthielt, resuspendiert und 3 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit R10 gewaschen und für den Efferozytosetest verwendet. Anschließend wurden Effektor- und apoptotische Zielzellen einzeln (als Kontrollen) oder in einem Verhältnis von einer Effektor-CD14+-Zelle zu drei apoptotischen Zielneutrophilen gemeinsam kultiviert. Die Zellen wurden 12 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Am Ende der Co-Kultur wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit 1 % Paraformaldehyd in PBS fixiert und auf einem FACSymphony A5 erfasst und mit der FACSDiva-Software (BD Biosciences) untersucht, indem alle gefärbten Zellen erfasst wurden. Die Daten wurden mit FlowJo v10.6 (TreeStar) weiter analysiert. Die Häufigkeit efferozytotischer CD14+-Zellen wurde als Häufigkeit doppelt positiver Zellen für CytoTell Blue und CFSE auf den CytoTell Blue-positiven Monozyten bestimmt. Der Efferozytosetest wurde in mehreren Experimenten durchgeführt, wobei jeweils paarweise Vor- und Nachimpfungen zusammen durchgeführt wurden. Um die Experimente zur Korrelationsanalyse zu kombinieren, wurden die Daten zur Efferozytose nach der Impfung (Woche 14) normalisiert, indem sie durch die Daten vor der Impfung dividiert und mit 100 multipliziert wurden.

Die Efferozytose wurde wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass der Co-Kultur 12 Stunden lang 100 μM SAMT-247 zugesetzt wurden. Die SAMT-247-induzierte Efferozytose wurde gemessen, indem die Efferozytose ohne SAMT-247-behandelte Effektorzellen von der Efferozytose mit SAMT-247-behandelten Effektorzellen abgezogen wurde.

Die Konzentrationen von NKG2A+ NK-Zellen wurden im Blut gesunder Menschen gemessen. Menschliche PBMCs wurden aufgetaut und in R10 in Gegenwart oder Abwesenheit von SAMT-247 und/oder PMA-Ionomycin 12 Stunden lang kultiviert. Die Zellen wurden mit oder ohne Zinkchelatbildner TPEN (Kat.-Nr. P4413-100MG, 5 μM) 12 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden PBMCs mit Folgendem oberflächengefärbt: BUV737 Anti-CD3 (SP34-2; Kat.-Nr. 741872, 5 μl), Alexa 700 Anti-CD20 (2H7; Kat.-Nr. 560631, 5 μl), BV786 Anti- CD45 (HI30; Kat.-Nr. 563716, 5 μl) von BD Biosciences; APC-H7 anti-CD11b (ICRF44; Kat.-Nr. 47-0118-42, 5 μl) von eBioscience und PE-Cy7 anti-NKG2A (Z199; Kat.-Nr. B10246, 5 μl) von Beckman Coulter für 30 min bei Zimmertemperatur. Anschließend erfolgte die Permeabilisierung mit dem FOXP3-Transkriptionspufferset (Kat.-Nr. 00-5523-00) von eBioscience gemäß Herstellerempfehlung und anschließende intrazelluläre Färbung mit: BV750 anti-TNF-α (MAB11; Kat.-Nr. 566359, 5 μl), BUV396 Anti-IFN-γ (B27; Kat.-Nr. 563563, 5 μl), BV510 Anti-GranB (GB11; Kat.-Nr. 563388, 5 μl) von BD Biosciences; und FITC anti-Perforin (pf-344; Kat.-Nr. 3465-7, 5 μl) von MABTECH für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Durchflusszytometrie-Erfassungen wurden auf einem FACSymphony A5 durchgeführt und mit der FACSDiva-Software (BD Biosciences) untersucht.

Aktivierungs-, Proliferations- und Erschöpfungsmarker auf Th1- und Th2-Zelluntergruppen wurden in Woche 17 bei geimpften Tieren im Blut mithilfe des AIM-Assays gemessen58. PBMCs wurden aufgetaut und mit CD40-blockierendem Antikörper (HB14, Kat.-Nr. 130-094-133, 5 μl) von Miltenyi 15 Minuten lang inkubiert, gefolgt von der Zugabe von CD49a (9F10, Kat.-Nr. 555501, 2 μl) und CD28 (CD28.2, Kat.-Nr. 567117, 2 μl) von BD Bioscience in Gegenwart oder Abwesenheit von gp120 und/oder SAMT-247. Die Zellen wurden 18 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, gefolgt von einer Antikörperfärbung. PBMCs wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Folgendem gefärbt: LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain (Kat.-Nr. L23105, Thermo Fisher); BV786 Anti-CD45 (D058-1283; Kat.-Nr. 563861, 5 μl), BUV737 Anti-CD3 (SP34-2; Kat.-Nr. 741872, 5 μl), BV711 Anti-CD4 (L200; Kat.-Nr. 740807 , 5 μl), BUV496 Anti-CD8 (RPA-T8; Kat.-Nr. 612942, 5 μl), PE-CF594 Anti-PDL1 (MIH1; Kat.-Nr. 563742, 5 μl), BB700 Anti-CTLA-4 ( BNI3; Kat.-Nr. 566901, 5 μl), PE-Cy5 anti-OX40 (CD134) (ACT35; Kat.-Nr. 551500, 5 μl), BUV563 anti-CD40L (CD154) (24-31; Kat.-Nr. 752854, 5 μl), PE-Cy7 anti-CD69 (FN50; Kat.-Nr. 557745, 5 μl), PE anti-CD95 (DX2; Kat.-Nr. 555674, 5 μl) von BD Bioscience; FITC Anti-LAG3 (3DS223H; Kat.-Nr. 369326, 5 μl) von Thermofisher; BV750 Anti-PD1 (EH12.2H7; Kat.-Nr. 329966, 5 μl), Alexa 700 Anti-CXCR3 (G025H7; Kat.-Nr. 353742, 5 μl), BV605 Anti-CCR6 (G034E3; Kat.-Nr. 353420, 5 μl) von BioLegend. Nach der Färbung erfolgte eine Permeabilisierung mit einem FOXP3-Transkriptionspufferset (Kat.-Nr. 00-5523-00) von eBioscience gemäß Herstellerempfehlung und anschließend eine intrazelluläre Färbung mit BV510 anti-Ki67 (B56; Kat.-Nr. 563462, 5 μl). ) von BD Biosciences für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Proben wurden mit einem BD FACSymphony A5-Zytometer erfasst und mit der FlowJo-Software 10.6 analysiert. Th1-Zellen wurden als Singuletts, lebende Zellen, CD45+-Zellen, CD3+, CD4+, CD8−, CD95+, CXCR3+, CCR6−; Th2-Zellen wurden als Singuletts, lebende Zellen, CD45+-Zellen, CD3+, CD4+, CD8–, CD95+, CXCR3–, CCR6– isoliert. Aktivierungs-, Proliferations- und Erschöpfungsmarker wurden auf die Elternpopulation bezogen.

Die Konzentrationen von NKG2A+ NK-Zellen und T-Zellen wurden im Blut geimpfter Makaken gemessen. Makaken-PBMCs wurden aufgetaut und in R10 in Gegenwart oder Abwesenheit von SAMT-247- und/oder gp120-gepoolten Peptiden 12 Stunden lang kultiviert. Die Zellen wurden mit oder ohne Zinkchelatbildner TPEN (Kat.-Nr. P4413-100MG, 5 μM) 12 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit Live/Dead Blue-Farbstoff (Kat.-Nr. L34962, 0,5 μl) von Thermo Fisher auf lebende Zellen gefärbt; Anschließend erfolgte die Oberflächenfärbung mit: PE Anti-CD45 (D058-1283; Kat.-Nr. 552833, 5 μl), BB700 Anti-CD3 (RPA-T8; Kat.-Nr. 566452, 5 μl), Alexa 700 Anti- CD3 (SP34-2; Kat.-Nr. 557917, 5 μl), BV711 Anti-CD4 (L200; Kat.-Nr. 563913, 5 μl), BV786 Anti-CCR5 (3A9; Kat.-Nr. 565001, 5 μl), BUV737 Anti-CD20 (2H7; Kat.-Nr. 612848, 5 μl), BUV496 Anti-CD16 (3G8; Kat.-Nr. 612944, 5 μl), BUV661 Anti-HLA-DR (G46-6; Kat.-Nr. 612980 , 5 μl), BUV805 Anti-CD14 (M5E2; Kat.-Nr. 565779, 5 μl) von BD Biosciences; APC-H7 Anti-CD11b (ICRF44; Kat.-Nr. 47-0118-42, 5 μl), PE-Cy5 Anti-CD95 (DX2; Kat.-Nr. 15-0959-42, 5 μl) von eBioscience; PE-Cy7 anti-NKG2A (Z199; Kat.-Nr. B10246, 5 μl) von Beckman Coulter; APC Anti-α4β7 (A4B7R1; Kat.-Nr. 051514AB, 5 μl) von der NIH Nonhuman Primate Reagent Resource (R24 OD010976 und NIAID-Vertrag HHSN272201300031C) und BV605 Anti-CCR6 (G034E3; Kat.-Nr. 353420, 5 μl) , BV650 Anti-CXCR3 (G025H7; Kat.-Nr. 353730, 5 μl) von BioLegend für 30 Min. bei Raumtemperatur. Anschließend erfolgte die Permeabilisierung mit dem FOX3-Transkriptionspufferset (Kat.-Nr. 00-5523-00) von eBioscience gemäß Herstellerempfehlung und anschließende intrazelluläre Färbung mit: BV750 anti-TNF-α (MAB11; Kat.-Nr. 566359, 5 μl), BUV396 Anti-IFN-γ (B27; Kat.-Nr. 563563, 5 μl), BV510 Anti-GranB (GB11; Kat.-Nr. 563388, 5 μl), BV421 Anti-IL-10 (JES3 -9D7; Kat.-Nr. 564053, 5 μl), PE-CF594 anti-Ki67 (B56; Kat.-Nr. 567120, 5 μl) von BD Biosciences; und FITC anti-Perforin (pf-344; Kat.-Nr. 3465-7, 5 μl) von MABTECH für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Durchflusszytometrie-Erfassungen wurden auf einem FACSymphony A5 durchgeführt und mit der FACSDiva-Software (BD Biosciences) untersucht.

NK/ILC- und T-Zell-Häufigkeiten sowie Zytokinspiegel wurden in der Makaken-Rektalschleimhaut gemessen. Frisch entnommene Rektalbiopsien wurden zu Einzelzellen verarbeitet und in R10 in Gegenwart/oder Abwesenheit von SAMT-247 und/oder PMA-Ionomycin 12 Stunden lang kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit Live/Dead Blue-Farbstoff (Kat.-Nr. L34962, 0,5 μl) von Thermo Fisher auf lebende Zellen gefärbt; Anschließend erfolgte die Oberflächenfärbung mit: BUV737 Anti-CD3 (SP34-2; Kat.-Nr. 741872, 5 μl), BV711 Anti-CD4 (L200; Kat.-Nr. 563913, 5 μl), BV650 Anti-NKp44 (P44). -8; Kat.-Nr. 744302, 5 μl), Alexa 700 Anti-CD20 (2H7; Kat.-Nr. 560631, 5 μl), BV786 Anti-CD45 (D058-1283; Kat.-Nr. 563861, 5 μl) von BD Biowissenschaften; APC-H7 Anti-CD11b (ICRF44; Kat.-Nr. 47-0118-42, 5 μl), PE-Cy5 Anti-CD95 (ICRF44; Kat.-Nr. 15-0959-42, 5 μl) von eBioscience; BV570 Anti-CD8 (RPA-T8; Kat.-Nr. 301038, 5 μl), BV605 Anti-CCR6 (G034E3; Kat.-Nr. 353420, 5 μl), APC Anti-CXCR3 (G025H7; Kat.-Nr. 353708, 5 μl) von BioLegend und PE-Cy7 anti-NKG2A (Z199; Kat.-Nr. B10246, 5 μl) von Beckman Coulter für 30 min bei Raumtemperatur. Anschließend erfolgte die Permeabilisierung mit einem FOXP3-Transkriptionspufferset (Kat.-Nr. 00-5523-00) von eBioscience gemäß Herstellerempfehlung und anschließende intrazelluläre Färbung mit: BV750 anti-TNF-α (MAB11; Kat.-Nr . 566359, 5 μl), BUV395 Anti-IFN-γ (B27; Kat.-Nr. 563563, 5 μl), BV510 Anti-GranB (GB11; Kat.-Nr. 563388, 5 μl), BV421 Anti-IL-10 ( JES3-9D7; Kat.-Nr. 564053, 5 μl) von BD Biosciences; PE-Cy5.5 anti-IL-17 (BL168; Kat.-Nr. 512314, 5 μl) von BioLegend; und FITC anti-Perforin (pf-344; Kat.-Nr. 3465-7, 5 μl) von MABTECH für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Durchflusszytometrie-Erfassungen wurden auf einem FACSymphony A5 durchgeführt und mit der FACSDiva-Software (BD Biosciences) untersucht.

NKG2A+ NK-Zellen wurden aus kryokonservierten gesunden menschlichen PBMCs isoliert. NK-Zellen wurden mit APC anti-NKG2A (Z199, Kat.-Nr. A60797) von Beckman Coulter markiert und der Lebensfähigkeitsfarbstoff Aqua Live/Dead wurde verwendet, um tote Zellen auszuschließen. Nach der Färbung wurden die Zellen gewaschen, durch ein 40-μm-Zellsieb gegeben und auf einem Astrios EQ-Durchflusszytometer sortiert. NKG2A+ lebender Zellen wurden mit einer Reinheit von 99 % sortiert. Anschließend wurden NK-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von SAMT-247 und/oder PMA-Ionomycin-Stimulation 7 Stunden lang kultiviert. Die Zellen wurden auf Ibidi-Kammerobjektträgern ausplattiert. Die Zellen wurden gewaschen und mit Zink-Chelator behandelt oder blieben entsprechend der Empfehlung des Herstellers 30 Minuten lang unbehandelt, wobei ein zellbasiertes Zink-Assay-Kit (Kat.-Nr. ab241014, Abcam) verwendet wurde. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und mit Zinksondengrün (Kat.-Nr. ab241014, Abcam) gefärbt und DAPI (Molecular Probes) wurde zur Visualisierung der Kerne verwendet. Die Signale wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Leica SP8, Leica Microsystems) sichtbar gemacht. Die Bildverarbeitung wurde mit der Software Imaris 9.2.1 (Oxford Instruments) durchgeführt.

Die statistische Analyse wurde durchgeführt, ohne die Normalverteilung und gleiche Varianzen der Daten zu testen, und daher wurden nichtparametrische Tests verwendet. Der zweiseitige Wilcoxon-Signed-Rank-Test oder der zweiseitige Mann-Whitney-Test wurde verwendet, um kontinuierliche Faktoren zwischen zwei gepaarten bzw. ungepaarten Gruppen zu vergleichen. Vergleiche der Unterschiede zwischen Gruppen in der Anzahl der Herausforderungen vor der Virusinfektion wurden mithilfe des Log-Rank-Tests (Mantel-Cox) des zeitdiskreten Proportional-Hazards-Modells bewertet. Die durchschnittliche Pro-Risiko-Provokation einer Virusinfektion wurde als Gesamtzahl der beobachteten Infektionen geteilt durch die Anzahl der verabreichten Provokationen geschätzt. Korrelationsanalysen wurden unter Verwendung der nichtparametrischen Spearman-Rank-Korrelationsmethode mit exakter Permutation und ungefähren zweiseitigen P-Werten durchgeführt, die für die Anzahl der Paare \(\le\)17 bzw. >17 berechnet wurden. Da diese Untersuchung explorativ durchgeführt wurde, werden alle P-Werte als Nominalwerte angegeben, ohne dass eine Anpassung für mehrere Vergleiche erfolgt. Es wurden keine Tiere oder Datenpunkte von den Analysen ausgeschlossen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten im Manuskript und ergänzendes Material sind in den beigefügten „Quelldaten“-Dateien enthalten. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

N / A.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01412-z

UNAIDS. Faktenblatt – Welt-Aids-Tag 2021 Vol. 2022 (UNAIDS, 2021).

Birdthistle, I. et al. Aktuelle Werte und Trends der HIV-Inzidenzraten bei heranwachsenden Mädchen und jungen Frauen in zehn afrikanischen Ländern mit hoher Prävalenz: eine systematische Überprüfung und Metaanalyse. Lancet Glob. Gesundheit 7, e1521–e1540 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Flynn, NM et al. Placebokontrollierte Phase-3-Studie mit einem rekombinanten Glykoprotein-120-Impfstoff zur Vorbeugung einer HIV-1-Infektion. J. Infizieren. Dis. 191, 654–665 (2005).

Artikel PubMed Google Scholar

Pitisuttithum, P. et al. Randomisierte, doppelblinde, placebokontrollierte Wirksamkeitsstudie eines bivalenten rekombinanten Glykoprotein-120-HIV-1-Impfstoffs bei Drogenkonsumenten in Bangkok, Thailand. J. Infizieren. Dis. 194, 1661–1671 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Buchbinder, SP et al. Wirksamkeitsbewertung eines zellvermittelten Immunitäts-HIV-1-Impfstoffs (die Step-Studie): eine doppelblinde, randomisierte, placebokontrollierte Test-of-Concept-Studie. Lancet 372, 1881–1893 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gray, GE et al. Sicherheit und Wirksamkeit der HVTN 503/Phambili-Studie eines Klade-B-basierten HIV-1-Impfstoffs in Südafrika: eine doppelblinde, randomisierte, placebokontrollierte Test-of-Concept-Phase-2b-Studie. Lanzetteninfektion. Dis. 11, 507–515 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gray, GE et al. Rekombinanter Adenovirus-Typ-5-HIV-gag/pol/nef-Impfstoff in Südafrika: unverblindete, langfristige Nachbeobachtung der Phase-2b-HVTN-503/Phambili-Studie. Lanzetteninfektion. Dis. 14, 388–396 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rerks-Ngarm, S. et al. Impfung mit ALVAC und AIDSVAX zur Vorbeugung einer HIV-1-Infektion in Thailand. N. engl. J. Med. 361, 2209–2220 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hammer, SM et al. Wirksamkeitsstudie eines vorbeugenden DNA/rAd5-HIV-1-Impfstoffs. N. engl. J. Med. 369, 2083–2092 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gray, GE et al. Impfstoffwirksamkeit von ALVAC-HIV und bivalentem Subtyp C gp120-MF59 bei Erwachsenen. N. engl. J. Med. 384, 1089–1100 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eine Studie zur Bewertung der Wirksamkeit eines heterologen Prime/Boost-Impfschemas von Ad26.Mos4.HIV und Aluminiumphosphat-adjuvantiertem Clade C gp140 bei der Vorbeugung einer Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus (HIV)-1 bei Frauen in Afrika südlich der Sahara. NIH https://ClinicalTrials.gov/show/NCT03060629 (2022).

Eine Studie zum heterologen Impfschema des humanen Immunschwächevirus Adenovirus Serotyp 26, Mosaik4 (Ad26.Mos4.HIV), der adjuvantierten Gruppe C gp140 und Mosaik gp140, um eine HIV-1-Infektion bei Männern mit Cis-Geschlecht und Transgender-Personen, die Sex mit Cis-Geschlecht haben, zu verhindern Männer und/oder Transgender-Personen. NIH https://ClinicalTrials.gov/show/NCT03964415 (2023).

Vaccari, M. et al. Adjuvansabhängige angeborene und adaptive Immunsignaturen zum Risiko einer SIVmac251-Akquisition. Nat. Med. 22, 762–770 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vaccari, M. et al. Die Aktivierung der Hypoxie und des Inflammasoms in CD14+-Monozyten durch den HIV-Impfstoffkandidaten ist mit einem verringerten Risiko einer SIVmac251-Akquisition verbunden. Nat. Med. 24, 847–856 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bissa, M. et al. Wirksamkeit eines HIV-Impfstoffkandidaten bei weiblichen Makaken, vermittelt durch cAMP-abhängige Efferozytose und V2-spezifisches ADCC. Nat. Komm. 14, 575 (2023).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Silva de Castro, I. et al. Anfälligkeit für Anti-V2-Antikörperviren durch Deletion der Hülle V1 bei HIV-Impfstoffkandidaten aufgedeckt. iScience 24, 102047 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haynes, BF et al. Immunkorrelatanalyse einer Studie zur Wirksamkeit des HIV-1-Impfstoffs. N. engl. J. Med. 366, 1275–1286 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goes, LR et al. Die V2-Schleife von HIV gp120 liefert über Integrin alpha4beta7 kostimulatorische Signale an CD4+ T-Zellen und fördert die Zellaktivierung und -infektion. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 117, 32566–32573 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gschwandtner, M., Derler, R. & Midwood, KS Mehr als nur attraktiv: Wie CCL2 das Verhalten myeloider Zellen über die Chemotaxis hinaus beeinflusst. Vorderseite. Immunol. 10, 2759 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tomalka, JA et al. Der Transkriptionsfaktor CREB1 ist ein mechanistischer Treiber der Immunogenität und einer verringerten HIV-1-Akquisition nach der ALVAC-Impfung. Nat. Immunol. 22, 1294–1305 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Negreiros-Lima, GL et al. Zyklisches AMP reguliert über PKA Schlüsselfunktionen von Makrophagen: Rekrutierung, Neuprogrammierung und Efferozytose. Zellen 9, 128 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Doran, AC, Yurdagul, A. Jr. & Tabas, I. Efferozytose in Gesundheit und Krankheit. Nat. Pfr. Fr. Immunol. 20, 254–267 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rahman, MA et al. Unterschiedliche Wirkung von mukosalen NKp44+-angeborenen Lymphoidzellen und Deltaammazellen auf den Ausgang einer Affen-Immundefizienzvirus-Infektion bei Rhesusaffen. J. Immunol. 203, 2459–2471 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Turpin, JA, Schito, ML, Jenkins, LM, Inman, JK & Appella, E. Topische Mikrobizide: ein vielversprechender Ansatz zur Bekämpfung der AIDS-Pandemie durch retrovirale Zinkfinger-Inhibitoren. Adv. Pharm. 56, 229–256 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Jenkins, LM et al. Untersuchungen zum Mechanismus der Inaktivierung des HIV-1-Nukleokapsidproteins NCp7 mit 2-Mercaptobenzamidthioestern. J. Med. Chem. 48, 2847–2858 (2005).

Artikel PubMed Google Scholar

Turpin, JA et al. Inhibitoren der Zinkfinger des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 verhindern die normale Verarbeitung von Gag-Vorläufern und führen zur Freisetzung nichtinfektiöser Viruspartikel. J. Virol. 70, 6180–6189 (1996).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Miller Jenkins, LM et al. Inaktivierung kleiner Moleküle von HIV-1 NCp7 durch wiederholten intrazellulären Acyltransfer. Nat. Chem. Biol. 6, 887–889 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wallace, GS et al. Nukleokapsid-Inhibitoren des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 verhindern die Transinfektion in Zell- und Explantatmodellen und schützen nichtmenschliche Primaten vor Infektionen. J. Virol. 83, 9175–9182 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schito, ML et al. Antivirale In-vivo-Aktivität neuartiger Nukleokapsid-p7-Zinkfinger-Inhibitoren des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 in einem transgenen Mausmodell. AIDS Res. Summen. Retroviren 19, 91–101 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cheng-Mayer, C. et al. Verzögerung der Infektion mit dem Affen-Human-Immundefizienz-Virus und Kontrolle der Virusreplikation bei geimpften Makaken, denen ein topisches Mikrobizid ausgesetzt war. AIDS 25, 1833–1841 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Helmold Hait, S. et al. Ein SAMT-247-Mikrobizid bietet wirksamen Schutz gegen die intravaginale Simian-Immundefizienzvirus-Infektion von Rhesusaffen, wohingegen eine zusätzliche Impfstoffkomponente gemischte Ergebnisse hervorruft. J. Immunol. 204, 3315–3328 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Henson, PM Zellentfernung: Efferozytose. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 33, 127–144 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cicala, C. et al. Das Integrin alpha4beta7 bildet einen Komplex mit CD4 auf der Zelloberfläche und definiert eine T-Zell-Untergruppe, die sehr anfällig für eine Infektion durch HIV-1 ist. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 106, 20877–20882 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kader, M., Bixler, S., Roederer, M., Veazey, R. & Mattapallil, JJ CD4-T-Zell-Untergruppen in der Schleimhaut sind CD28+Ki-67-HLA-DR-CD69+, zeigen jedoch eine unterschiedliche Infektion basierend auf dem Alpha4beta7-Rezeptor Expression während einer akuten SIV-Infektion. J. Med. Primatol. 38, 24–31 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Redmond, WL, Ruby, CE & Weinberg, AD Die Rolle der OX40-vermittelten Kostimulation bei der Aktivierung und dem Überleben von T-Zellen. Krit. Rev. Immunol. 29, 187–201 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blair, PJ et al. Der CD40-Ligand (CD154) löst eine kurzfristige CD4+-T-Zell-Aktivierungsreaktion aus, die zur Sekretion immunmodulatorischer Zytokine und Apoptose führt. J. Exp. Med. 191, 651–660 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cibrian, D. & Sanchez-Madrid, F. CD69: vom Aktivierungsmarker zum metabolischen Gatekeeper. EUR. J. Immunol. 47, 946–953 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Soares, A. et al. Neuartige Anwendung von Ki67 zur Quantifizierung der antigenspezifischen In-vitro-Lymphoproliferation. J. Immunol. Methoden 362, 43–50 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parry, RV et al. CTLA-4- und PD-1-Rezeptoren hemmen die T-Zell-Aktivierung durch unterschiedliche Mechanismen. Mol. Zelle. Biol. 25, 9543–9553 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blank, C. & Mackensen, A. Beitrag des PD-L1/PD-1-Signalwegs zur T-Zell-Erschöpfung: ein Update zu den Auswirkungen auf chronische Infektionen und Tumorumgehung. Krebsimmunol. Immunander. 56, 739–745 (2007).

Artikel PubMed Google Scholar

Tian, ​​X. et al. Die Hochregulierung von LAG-3 auf T-Zellen definiert eine Subpopulation mit funktioneller Erschöpfung und korreliert mit dem Fortschreiten der Krankheit bei HIV-infizierten Personen. J. Immunol. 194, 3873–3882 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Read, SA, Obeid, S., Ahlenstiel, C. & Ahlenstiel, G. Die Rolle von Zink bei der antiviralen Immunität. Adv. Nutr. 10, 696–710 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Prasad, AS, Miale, A. Jr., Farid, Z., Sandstead, HH & Schulert, AR Zinkstoffwechsel bei Patienten mit dem Syndrom von Eisenmangelanämie, Hepatosplenomegalie, Zwergwuchs und Hypognadismus. J. Lab. Klin. Med. 61, 537–549 (1963).

CAS PubMed Google Scholar

Tone, K., Suzuki, T. & Todoroki, T. Einfluss von Zinkmangel auf die Phagozytose bei Mäusen. Kitasato-Bogen. Exp. Med 64, 263–269 (1991).

CAS PubMed Google Scholar

Wirth, JJ, Fraker, PJ & Kierszenbaum, F. Zinkbedarf für die Makrophagenfunktion: Auswirkung von Zinkmangel auf die Aufnahme und Abtötung eines Protozoenparasiten. Immunology 68, 114–119 (1989).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hamon, R. et al. Zink und Zinktransporter in Makrophagen und ihre Rolle bei der Efferozytose bei COPD. PLoS ONE 9, e110056 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Haase, H. et al. Zinksignale sind für die Lipopolysaccharid-induzierte Signalübertragung in Monozyten essentiell. J. Immunol. 181, 6491–6502 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jenkins, JL & Urban, L. Phänotypisches Screening: Angeln nach neuroaktiven Verbindungen. Nat. Chem. Biol. 6, 172–173 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Miller Jenkins, LM et al. Hemmung der HIV-Reifung durch selektive Entfaltung und Vernetzung des Gag-Polyproteins durch einen Mercaptobenzamid-Acetylator. Marmelade. Chem. Soc. 141, 8327–8338 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lambert, SA et al. Die menschlichen Transkriptionsfaktoren. Zelle 172, 650–665 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Andreini, C. & Bertini, I. Eine bioinformatische Sicht auf Zinkenzyme. J. Inorg. Biochem. 111, 150–156 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gammoh, NZ & Rink, L. Zink bei Infektionen und Entzündungen. Nährstoffe 9, 624 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wessels, I., Maywald, M. & Rink, L. Zink als Torwächter der Immunfunktion. Nährstoffe 9, 1286 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Sheikh, A. et al. Zink beeinflusst die angeborene Immunantwort bei Kindern mit enterotoxischem, durch Escherichia coli verursachtem Durchfall. J. Nutr. 140, 1049–1056 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kjellerup, L., Winther, AL, Wilson, D. & Fuglsang, AT Die Aktivierung des zyklischen AMP-Signalwegs und extrazelluläres Zink induzieren bei Candida albicans eine schnelle intrazelluläre Zinkmobilisierung. Vorderseite. Mikrobiol. 9, 502 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kido, T., Suka, M. & Yanagisawa, H. Wirksamkeit der Verabreichung von Interleukin-4 oder einer Zinkergänzung bei der Verbesserung der mit Zinkmangel verbundenen Thymusatrophie und Fettdegeneration sowie bei der Normalisierung des T-Zell-Reifungsprozesses. Immunologie 165, 445–459 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Orlandi, C., Flinko, R. & Lewis, GK Eine neue Zelllinie für HIV-spezifische Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) und Virusübertragungsstudien von Zelle zu Zelle mit hohem Durchsatz. J. Immunol. Methoden 433, 51–58 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reiss, S. et al. Vergleichende Analyse von aktivierungsinduzierten Markertests (AIM) zur empfindlichen Identifizierung antigenspezifischer CD4-T-Zellen. PLoS ONE 12, e0186998 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Korrespondenz und Materialanfragen sind an G. Franchini ([email protected]) zu richten. Wir danken D. Ahern für die redaktionelle und grafische Unterstützung. Wir danken J. Kramer, M. Breed, W. Magnanelli, M. Metrinko, K. Killoran und ihren Mitarbeitern für die fachmännische Betreuung der Rhesusaffen und die Sammlung aller Gewebe in der NCI-Tieranlage. Wir danken K. McKinnon und S. Brown für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Wir danken M. Robello für die Vorbereitung von SAMT-247, M. Gunawardana, AE Castonguay und I. Butkyavichene für ihre Bemühungen bei SAMT-247-Gelstabilitäts- und Bioanalysemessungen. Wir danken T. Misteli für die hilfreiche Diskussion. Das folgende Reagenz wurde über das NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH erhalten: APC anti-α4β7 (A4B7R1; Kat.-Nr. 051514AB) von der NIH Nonhuman Primate Reagent Resource (R24 OD010976 und NIAID-Vertrag HHSN272201300031C). Diese Arbeit wurde mit Bundesmitteln des Intramural Research Program der National Institutes of Health unterstützt. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Ministeriums für Gesundheit und menschliche Dienste wider, und die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen impliziert auch keine Billigung durch die US-Regierung.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Rahman, MA, Bissa, M., Silva de Castro, I., Helmold Hait, S.

Abteilung für Tiermodelle und retrovirale Impfstoffe, National Cancer Institute, Bethesda, MD, USA

Mohammad Arif Rahman, Massimiliano Bissa, Isabela Silva de Castro, James D. Stamos, Sarkis Sarkis, Anna Gutowska, Melvin N. Doster, Ramona Moles und Genoveffa Franchini

Abteilung für Immunbiologie retroviraler Infektionen, National Cancer Institute, Bethesda, MD, USA

Sabrina Helmold Hait, Ruth Hunegnaw, Tanya Hoang und Marjorie Robert-Guroff

Abteilung für translatorische autoinflammatorische Erkrankungen, Labor für klinische Immunologie und Mikrobiologie, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

Farzana Bhuyan

Kollaborative Ressource für Proteintechnologie, Labor für Zellbiologie, National Cancer Institute, Bethesda, MD, USA

Lisa M. Miller Jenkins

Abteilung für chemische Immunologie, National Cancer Institute, Bethesda, MD, USA

Ettore Appella

Abteilung für Biostatistik und Datenmanagement, Zentrum für Krebsforschung, National Cancer Institute, Bethesda, MD, USA

David J. Venzon und Hyoyoung Choo-Wosoba

New York University School of Medicine, NYU Langone Health, New York, NY, USA

Timothy Cardozo

Oak Crest Institute of Science, Monrovia, Kalifornien, USA

Marc M. Baum

Abteilung für synthetische bioaktive Moleküle, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

Daniel H. Appella

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GF und MR-G. konzipierte die Studie. MAR und GF haben das Papier mit Beiträgen aller Autoren verfasst; MAR koordinierte die Makakenstudien, führte ADCC-Assays, Zinkhemmungsassays, Analysen der angeborenen Schleimhautreaktion, Phänotypisierungs- und intrazelluläre Zytokin-Assays sowie AIM-Assays durch, analysierte die Daten und bereitete die Zahlen vor; MB führte Efferozytosetests und Zelltests durch und koordinierte die Makakenstudien und verarbeitete Proben. ISdC koordinierte die Makakenstudien und führte T-Zell-Assays durch und verarbeitete Proben; SHH koordinierte die Makakenstudien und verarbeitete Proben; JDS führte T-Zell-Assays durch; FB führte die Fluoreszenzmikroskopietests durch und analysierte die Daten; RH, SS, AG, MND, RM und TH verarbeiteten Proben und führten Experimente durch; LMM-J., EA und DHA stellten das Mikrobizid SAMT-247 und HEC-Gel zur Verfügung; TC trug zum Studiendesign bei; MMB überwachte die In-vitro-Studien zur Arzneimittel- und Gelstabilität und analysierte die Daten. DJV und HC-W. führte eine statistische Analyse der Daten durch.

Korrespondenz mit Genoveffa Franchini.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen. Die US-Regierung hat das Patent Nr. 63/228.707 angemeldet: HIV-Impfung und SAMT-247-Mikrobizid zur Vorbeugung einer HIV-Infektion.

Nature Microbiology dankt Mirko Paiardini, Rama Amara und Steven de Rosa für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a) Es wurden keine Unterschiede in der verzögerten Akquisition in der gleichzeitigen Kontrollgruppe im Vergleich zu den historischen Kontrollen beobachtet (P = 0,74). Signifikanter Schutz oder Schutztrend in b, c) der Impfstoffgruppe (P = 0,006 bzw. P = 0,18) und d, e) Impfstoff + SAMT-247-Gruppe (P = 0,0002 bzw. P < 0,0001) im Vergleich zur gleichzeitigen Impfung oder historische Kontrollen. f, g) Es wurden keine Unterschiede in der verzögerten Erfassung in der SAMT-247-Gruppe im Vergleich zu gleichzeitigen (P = 0,59) oder historischen Kontrollen (P = 0,24) beobachtet. Die in (ag) gezeigten Daten wurden mit dem Log-Rank-Test (Mantel-Cox) analysiert.

Quelldaten

a) Plasma-Antikörpertiter gegen ∆V1 gp120 im Verlauf der Immunisierung in der Impfstoff+SAMT-247-Gruppe (n = 20) und der Impfstoffgruppe (n = 18). b) Plasma-Antikörperreaktionen gegen verschiedene Peptide, die die Schleifenregionen V1 (Peptide 15–24) und V2 (Peptide 25–29) von gp120 in der Impfstoff+SAMT-247-Gruppe (n = 20) und der Impfstoffgruppe (n = 18) umfassen. (ce) Vergleich von c) ADCC-Titer (P = 0,44), d) V2-spezifischer (NCI05-spezifischer) ADCC-Aktivität (P = 0,33) und e) V2-spezifischer (NCI09-spezifischer) ADCC-Aktivität (P = 0,13) in Woche 17 in der Impfstoff+SAMT-247-Gruppe (n = 20) und der Impfstoffgruppe (n = 18). (fg) Korrelation von f) ADCC-Aktivität und g) ADCC-Titer in der Impfstoffgruppe (n = 18). (hi) Korrelation von h) ADCC-Aktivität und i) ADCC-Titer in der Impfstoff+SAMT-247-Gruppe (n = 20), (jm) V2-spezifischer (NCI05- und NCI09-spezifischer) ADCC-Aktivität mit der Anzahl intravaginaler Herausforderungen in der Impfstoffgruppe (n = 18) und der Impfstoff+SAMT-247-Gruppe (n = 20). Die in (a, ce) gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test oder dem zweiseitigen Mann-Whitney-Test analysiert. Die in (fm) gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Spearman-Korrelationstest analysiert. Horizontale und vertikale Balken geben den Mittelwert und die Standardabweichung an.

Quelldaten

a, b) Intrazelluläres Granzym B, Perforin, IFN-γ und TNF-α in gesunden NKG2A+-Blutzellen des Menschen (n = 6) in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Reize. c) Vergleich Env-spezifischer rektaler NKp44+IL-17+-Zellen zwischen Impfstoff+SAMT-247 (n = 20) und der Impfstoffgruppe (n = 18) 1 Woche nach der letzten Impfung (P = 0,43). d) Korrelation rektaler mukosaler Env-spezifischer NKp44+IL-17+-Zellen mit der Anzahl intravaginaler Provokationen in der Impfstoffgruppe (n = 18). e) Gating von NKG2A+NK-Zellen, NKp44+ILCs und NKG2A–NKp44–ILCs in rektalen Schleimhautproben in Gegenwart von PMA oder PMA + SAMT-247 12 Stunden nach der Stimulation. Das Gating erfolgte an lebenden Singulettzellen, CD45+-, CD3−-, CD20−- und CD11b−-Zellen. f) Gating von NKp44+IL-17+ ILCs in der rektalen Schleimhautprobe in Gegenwart von PMA oder PMA + SAMT-247 12 Stunden nach der Stimulation. g) Korrelation des Efferozytose-Prozentsatzes mit der Anzahl intravaginaler Provokationen in der Impfstoff+SAMT-247-Gruppe (n = 20). (hi) Vergleich von h) Prozentsatz der Efferozytose (P < 0,0001) und i) Efferozytose-MFI (P < 0,0001) unter Verwendung von Prä-CD14+-Monozyten bei allen geimpften Tieren (n = 38). Die in (a, b, h, i) gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test oder dem zweiseitigen Mann-Whitney-Test analysiert. Die in (d, g) gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Spearman-Korrelationstest analysiert.

Quelldaten

a) Gating-Strategie von Th1- und Th2-Zellen, b,c) Vergleich von CCR5+α4β7+ (P < 0,0001 bzw. P = 0,01) und d,e) CCR5−α4β7-Speicher (P < 0,0001 bzw. P < 0,0001). ) Th1- und Th2-Zellen vor der Impfung und 1 Woche nach der letzten Impfung (Woche 13) im Blut (n = 38). Die in (be) gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test analysiert. Horizontale und vertikale Balken geben den Mittelwert und die Standardabweichung an.

Quelldaten

Expression von a) OX40, b) CD40L, c) CD69, d) Ki67, e) LAG3, f) CTLA-4, g) PD-1 und h) PDL-1 in Th1-Zellen bei Stimulation im Impfstoff+SAMT- 247-Gruppe (n = 4) und Impfstoffgruppe (n = 2). Die in (ah) gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test analysiert. Horizontale und vertikale Balken geben den Mittelwert und die Standardabweichung an.

Quelldaten

Expression von a) OX40, b) CD40L, c) CD69, d) Ki67, e) LAG3, f) CTLA-4, g) PD-1 und h) PDL-1 in Th2-Zellen bei Stimulation im Impfstoff+SAMT- 247-Gruppe (n = 4) und Impfstoffgruppe (n = 2). Die in (ah) gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test analysiert. Horizontale und vertikale Balken geben den Mittelwert und die Standardabweichung an.

Quelldaten

a, b) Häufigkeit von Th1-Zellen und Th2-Zellen in der Rektumschleimhaut von Makaken (n = 9). cg) Vergleich der Expression von Granzym B, Perforin, IFN-γ und TNF-α durch NKG2A+-Zellen von gesunden Menschen (n = 6) in Abwesenheit oder Anwesenheit von Zinkchelator und Stimuli (n = 6). Die in (ag) gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test analysiert. Horizontale und vertikale Balken geben den Mittelwert und die Standardabweichung an. Das Radardiagramm stellt den mittleren prozentualen Wert der Zytokinreaktionen dar. Durchgezogene Linien stellen das Fehlen von Zinkchelatbildner dar und gestrichelte Linien stellen das Vorhandensein von Zinkchelatbildner dar.

Quelldaten

af) Vergleich der intrazellulären Expression von IFN-γ, TNF-α und IL-10 durch CCR5+α4β7+- und CCR5−α4β7-Th1-Gedächtniszellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von Zinkchelator und Stimuli in der Impfstoff+SAMT-247-Gruppe ( n = 4) und Impfgruppe (n = 2). Die in (af) gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test analysiert. Horizontale und vertikale Balken geben den Mittelwert und die Standardabweichung an.

Quelldaten

af) Vergleich intrazellulärer IFN-γ-, TNF-α- und IL-10-Zytokine durch CCR5+α4β7+- und CCR5−α4β7-Th2-Gedächtniszellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von Zinkchelatbildnern und Stimuli in der Impfstoff+SAMT-247-Gruppe (n = 4) und Impfgruppe (n = 2). Die in (af) gezeigten Daten wurden mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test analysiert. Horizontale und vertikale Balken geben den Mittelwert und die Standardabweichung an.

Quelldaten

Rohdaten für Abb. 1.

Rohdaten für Abb. 2.

Rohdaten für Abb. 3.

Rohdaten für Abb. 4.

Rohdaten für Abb. 5.

Rohdaten für Extended Data Abb. 1.

Rohdaten für Extended Data Abb. 2.

Rohdaten für Extended Data Abb. 3.

Rohdaten für Extended Data Abb. 4.

Rohdaten für Extended Data Abb. 5.

Rohdaten für Extended Data Abb. 6.

Rohdaten für Extended Data Abb. 7.

Rohdaten für Extended Data Abb. 8.

Rohdaten für Extended Data Abb. 9.

Rohdaten für Abb. 4a,b.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Rahman, MA, Bissa, M., Silva de Castro, I. et al. Impfstoff plus Mikrobizid verhindern wirksam die vaginale SIV-Übertragung bei Makaken. Nat Microbiol 8, 905–918 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01353-7

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Eingegangen: 02. August 2022

Angenommen: 02. März 2023

Veröffentlicht: 06. April 2023

Ausgabedatum: Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01353-7

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