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Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 682 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Alkoholische Lebererkrankungen (ALD) und andere Formen chronischer hepatotoxischer Schäden können zu einer durch den transformierenden Wachstumsfaktor β1 (TGFβ1) induzierten Leberfibrose und einer beeinträchtigten Leberfunktion führen, was die Notwendigkeit unterstreicht, neuartige Behandlungen für diese Erkrankungen zu entwickeln. Hierin zeigen unsere Analysen von Lebergewebeproben von Patienten mit schwerer alkoholischer Hepatitis (SAH) und zwei Mausmodellen von ALD, dass der ALD-Phänotyp mit einer Hochregulierung des Transkriptionsfaktor-ETS-Domänen-enthaltenden Proteins (ELK-3) und der ELK-3-Signalisierung verbunden war Aktivität gekoppelt mit einer Herunterregulierung der α/β-Hydrolasedomäne mit 10 (ABHD10) und einer Hochregulierung der deaktivierenden S-Palmitoylierung des antioxidativen Proteins Peroxiredoxin 5 (PRDX5). In vitro zeigen wir außerdem, dass ELK-3 direkt an den ABHD10-Promotor binden kann, um dessen Transaktivierung zu hemmen. Die Signalübertragung von TGFβ1 und epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) induziert über ELK-3 die Herunterregulierung von ABHD10 und die S-Palmitoylierung von PRDX5. Diese ELK-3-vermittelte Herunterregulierung von ABHD10 führt zu oxidativem Stress und stört die Funktion reifer Hepatozyten, indem sie die S-Palmitoylierung des Cys100-Rests von PRDX5 verstärkt. In vivo lindert die ektope Überexpression von Abhd10 Leberschäden bei ALD-Modellmäusen. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die therapeutische Ausrichtung auf die ABHD10-PRDX5-Achse einen praktikablen Ansatz zur Behandlung von ALD und anderen Formen der Hepatotoxizität darstellen könnte.

Eine hepatotoxische Schädigung resultiert aus einer Schädigung der Hepatozyten durch eine alkoholische Lebererkrankung (ALD), eine Infektion (z. B. Hepatitis B und C) oder eine nichtalkoholische Steatohepatitis. Eine chronische hepatotoxische Schädigung kann zu Leberfibrose führen – einer schwerwiegenden, fortschreitenden Erkrankung, die durch die fehlerhafte Aktivierung fibrotischer Regenerationsprozesse entsteht. Bei der Leberfibrose kommt es zu einer umfangreichen Ablagerung von Typ-I-Kollagen und anderen extrazellulären Matrixbestandteilen in der Leber, was zur Entwicklung von Narbengewebe und einer Beeinträchtigung der Leberfunktion führt1. Hepatotoxische Schäden und Fibrose wurden mit dem epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) in Hepatozyten in Verbindung gebracht, einem Dedifferenzierungsprozess, der durch einen Verlust epithelähnlicher Zelleigenschaften gekennzeichnet ist2,3. Der fibrogene Zytokin-transformierende Wachstumsfaktor β1 (TGFβ1) treibt die EMT-Induktion voran und gilt als wichtiger Regulator hepatotoxischer Schäden und Fibrose4. TGFβ1 kann sowohl an die Typ-I- als auch an die Typ-II-Rezeptoren (TGFβRI und TGFβRII) binden, um die Serin-/Threonin-Kinase-Aktivität und die nachgeschaltete Signalübertragung zu induzieren3. Eine EMT-Induktion in Hepatozyten wurde in TGFβ1-behandelten primären Hepatozyten5 sowie in primären Hepatozyten, die aus einem CCl4-induzierten Modell der Leberzirrhose stammen6, nachgewiesen. Bemerkenswert ist, dass die TGFβ1-gesteuerte Hepatozyten-EMT-Induktion mit der Hochregulierung des ETS-Domänen-enthaltenden Proteins (ELK-3) in Verbindung gebracht wurde, wobei eine ähnliche Hochregulierung auch in zirrhotischen Gewebeproben von menschlichen Patienten und im CCl4-induzierten Modellsystem zu beobachten ist7. Die Stummschaltung von ELK-3 und die Unterdrückung des RAS-ELK-3-Signalwegs hemmen die EMT-Marker-Genexpression weiter, was ELK-3 als Schlüsselregulator für TGFβ1-bedingte hepatotoxische Schäden und Fibrose hervorhebt7.

Bisher sind die nachgeschalteten Mechanismen, durch die die TGFβ1-gesteuerte ELK-3-Signalübertragung hepatotoxische Schäden und Fibrose reguliert, unklar. Unsere vorläufigen Analysen ergaben eine konservierte ELK-3-Bindungsstelle innerhalb der Promotorregion der α/β-Hydrolasedomäne, die 10 (ABHD10) enthält, ein Redox-Homöostase-bezogenes Gen, das in Hepatozyten stark exprimiert wird8,9,10. Hierin führten wir bioinformatische Analysen bei schwerer alkoholischer Hepatitis (SAH) und gesunden Kontrolllebertranskriptomen durch, um Genmodule und Gene zu identifizieren, die mit alkoholinduzierter hepatotoxischer Schädigung und Fibrose assoziiert sind. Wir fanden heraus, dass Lebergewebeproben von SAH-Patienten und zwei Mausmodellen von ALD eine Hochregulierung der ELK-3-Expression und der ELK-3-Signalaktivität in Verbindung mit einer Herunterregulierung von ABHD10 und einer Hochregulierung der deaktivierenden S-Palmitoylierung des antioxidativen Proteins Peroxiredoxin 5 (PRDX5) aufweisen. In vitro zeigen wir außerdem, dass ELK-3 direkt an den ABHD10-Promotor binden kann, um dessen Transaktivierung zu hemmen. Wir zeigen, dass die Signalübertragung von TGFβ1 und dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) die Hepatozyten-ABHD10 über ELK-3 herunterreguliert. Wir liefern Beweise dafür, dass ABHD10 oxidativen Stress hemmt und die Funktion reifer Hepatozyten fördert, indem es S-palmitoyliertes PRDX5 herunterreguliert. In vivo zeigen wir, dass ektopische Abhd10-Überexpression Leberschäden bei ALD-Modellmäusen lindert. Daher könnte die therapeutische Ausrichtung auf die ABHD10-PRDX5-Achse einen praktikablen Ansatz zur Behandlung von ALD und anderen Formen der Hepatotoxizität darstellen.

Durch die Beurteilung von Gen-Koexpressionsmustern können biologisch relevante funktionelle Zusammenhänge zwischen Genen in Krankheitszuständen identifiziert werden. Daher führten wir eine Koexpressionsmodul-Identifikationsanalyse von Lebergewebe-Transkriptomen von SAH-Patienten (Maddrey-Diskriminanzfunktion >32) (n = 15) im Vergleich zu denen gesunder Kontrollpersonen (n = 7) durch (GEO-Zugangsnr.: GSE28619)11 um Genmodule zu identifizieren, die mit Leberfibrose assoziiert sind. Diese Analyse ergab 15 Genmodule, die für SAH signifikant angereichert waren (adj. p-Wert <0, 05; Abb. 1a und Supp. Table S4). M3, M4 und M7 waren die größten dieser 15 Module (Abb. 1b). Wir haben das größte Modul unter diesen – M3 – für weitere Untersuchungen ausgewählt. M3-Mitgliedsgene wurden einer Reactome-Gen-Set-Anreicherungsanalyse unterzogen. M3 war hinsichtlich des Aminosäurestoffwechsels, des Steroidstoffwechsels, des Glyoxylatstoffwechsels und des Glycinabbaus signifikant angereichert (Supp. Abb. S1).

Eine Co-Expressionsmodul-Identifikationsanalyse identifiziert unterschiedliche Co-Expressions-Genmodule von Patienten mit schwerer alkoholischer Hepatitis (SAH) (n = 15) im Vergleich zu gesunden Kontroll-Lebergewebeproben (Strg) (n = 7) (GEO-Zugriffsnummer: GSE28619). . Die Größe des Kreises ist proportional zur Modulgenzugehörigkeit, während die Farbe dem normalisierten Anreicherungsscore (NES) entspricht. b Netzwerkdiagramme für die drei größten differentiellen Koexpressions-Genmodule (M3, M4 und M7) mit Hervorhebung ihrer Hub-Gene. c Vulkandiagramm, das signifikant hochregulierte und herunterregulierte M3-differentiell exprimierte Gene (DEGs) in SAH im Vergleich zu gesunden Kontrolllebergewebeproben zeigt (adj. p < 0,05). d Sterndiagramm, das M3-DEGs zeigt, die positiv (r > 0,5, FDR <0,05; blau) oder negativ (r < −0,5, FDR <0,05; rot) mit ABHD10 (goldener Hub) korrelieren. Die Knotengröße ist proportional zum │r│-Wert, während der Abstand des Knotens vom Gold-Hub proportional zum FDR ist. e Heatmaps, die die zehn am positivsten korrelierenden M3-DEGs (oben) und die zehn am negativsten korrelierenden M3-DEGs (unten) mit ABHD10 veranschaulichen. f Reaktompfad-Anreicherungsanalysen für die ABHD10-korrelierenden M3-DEGs.

Die auf Limma basierende DEG-Analyse ergab 4282 hochregulierte DEGs und 3078 herunterregulierte DEGs (Adj. P <0, 05) im SAH-Lebergewebe im Vergleich zum gesunden Kontrolllebergewebe (Abb. 1c). Insbesondere wurde festgestellt, dass das M3-Modulmitglied ABHD10 im SAH-Lebergewebe herunterreguliert ist. Wir haben eine lineare Regressionsanalyse für alle M3-DEGs durchgeführt (Supp. Abb. S2), um zu bestimmen, welche signifikante Korrelationen mit ABHD10 aufweisen. Insgesamt 376 M3-DEGs zeigten signifikante Korrelationen mit ABHD10 (adj. P <0,05), wobei 55 M3-DEGs starke Korrelationen (│r│>0,5) mit ABHD10 zeigten (Abb. 1d, e). Die Reaktom-Gen-Set-Anreicherungsanalyse des ABHD10-korrelierenden M3-DEG-Sets (n = 376) ergab eine signifikante Anreicherung für den peroxisomalen Proteinimport (Abb. 1f). Konsequenterweise reguliert das ABHD10-Enzym die antioxidative Aktivität des peroxisomalen Proteins Peroxiredoxin 5 (PRDX5) durch S-Depalmitoylierung8 negativ. Da PRDX5 ein wichtiger Unterdrücker von oxidativem Stress im Lebergewebe ist12, könnte die Herunterregulierung von ABHD10 eine Rolle bei der Unterdrückung der PRDX5-basierten antioxidativen Aktivität spielen und dadurch Leberfibrose fördern.

Um diese Ergebnisse zu validieren, wurde eine Reihe von Studien an Lebergewebeproben einer unabhängigen AH-Patientenkohorte (n = 10) und einer demografisch passenden gesunden Kontrollkohorte (n = 10) durchgeführt (Abb. 2a). Wir haben das Vorhandensein mehrerer Indikatoren für eine Lebererkrankung bei AH-Patienten bestätigt: verringertes Serumalbumin, erhöhtes Gesamtbilirubin im Serum und erhöhte INR (Abb. 2b – d). Wir haben bestätigt, dass die ABHD10-mRNA-Expression in Lebergewebeproben von AH-Patienten deutlich herunterreguliert war (Abb. 2e). Darüber hinaus wurden signifikante Korrelationen zwischen der ABHD10-mRNA-Expression und Serumalbumin (r = 0,73, p < 0,05), Gesamtbilirubin im Serum (r = –0,72, p < 0,05) und INR (r = –0,70, p < 0,05) beobachtet ( Abb. 2f–h). Durch immunhistochemische Färbeanalyse wurde das ABHD10-Protein in Hepatozyten von AH-Patienten in wesentlich geringeren Mengen exprimiert (Abb. 2i). Darüber hinaus war die ABHD10-Proteinexpression in Lebergewebeproben von AH-Patienten herunterreguliert, während S-palmitoyliertes Prdx5 hochreguliert war (Abb. 2j).

a Es wurden Blut- und Lebergewebeproben von gesunden Kontrollpersonen (Ctrl) (n = 10) und Patienten mit schwerer alkoholischer Hepatitis (SAH) (n = 10) analysiert. b Serumalbumin, c Bilirubin und d INR bei SAH-Patienten und gesunden Kontrollpersonen. e ABHD10-Spiegel bei SAH-Patienten und gesunden Kontrollpersonen, analysiert mittels qPCR. HPRT1 wurde als Haushaltskontrolle verwendet. f–h Korrelationen zwischen relativen ABHD10-Spiegeln und f-Serumalbumin-, g-Bilirubin- und h-INR-Spiegeln bei SAH-Patienten. Die ABHD10-Proteinexpression wurde bei SAH- und Kontrollpatienten unter Verwendung von ABHD10-spezifischen Antikörpern halbquantitativ bewertet (0, nein/niedrig; 1, mittel; 2, hoch; 3, sehr hoch). Maßstabsbalken = 100 μm. j ABHD10- und S-Palm-PRDX5-Proteinspiegel, jeweils densitometrisch gemessen mittels Standard-Immunblotting und Streptavidin-Pulldown-basiertem Immunblotting. Calnexin wurde als S-palmitoylierte Kontrolle und β-Actin als Beladungskontrolle verwendet. k Das DNA-Bindungsmotiv von Taipale ELK-3 (links) und schematische Darstellung der ABHD10-Promotorregion (−1 kb von der Transkriptionsstartstelle [TSS] entfernt), wobei die konservierte Bindungsstelle von Taipale ELK-3 blau markiert ist (rechts). l ELK-3-Proteinspiegel werden mittels Immunblotting densitometrisch gemessen. Als Beladungskontrolle wurde β-Actin verwendet. m Expression der ELK-3-Ziele EGR1, FOS und HIF1A analysiert über qPCR. HPRT1 wurde als Haushaltskontrolle verwendet. Daten werden als Mediane mit IQRs dargestellt. *P < 0,05, **P < 0,01 [b–d, e, j, l, m U-Test; f, g Pearson-Korrelationstest; und i Fishers genauer Test].

Menschliches zirrhotisches Lebergewebe und CCl4-induziertes murines fibrotisches Lebergewebe zeigen eine Hochregulierung des profibrogenen Transkriptionsfaktors ELK-3 (alternativ NET, ERP, SAP-2)7. Unsere In-silico-Promotoranalyse ergab eine konservierte ELK-3-Bindungsstelle in der ABHD10-Promotorregion 128–138 bp stromaufwärts des TSS (Abb. 2k). AH war mit einem Anstieg der ELK-3-Expression verbunden (Abb. 2l). Im Gegensatz zu ABHD10 waren die drei anderen ELK-3-Ziele EGR17, FOS13 und HIF1A14 in Lebergewebeproben von AH-Patienten deutlich hochreguliert (Abb. 2m).

Um unsere menschlichen Erkenntnisse zu validieren, wurde eine Reihe von Studien an Mausmodellen für ALD im frühen oder fortgeschrittenen Stadium durchgeführt (Abb. 3a). Das ALD-Modell im Frühstadium (dh EtOH für 3 Wochen unter HFD-Bedingungen) zeigte Leberschäden und Hepatozytensteatose ohne wesentliche Fibrose (Abb. 3b – h). Das schwere ALD-Mausmodellsystem (dh CCl4 für neun Wochen, gefolgt von EtOH unter HFD-Bedingungen) zeigte eine ausgeprägtere Leberschädigung mit perizellulärer Fibrose (Abb. 3b – h). Oxidativer Stress im Lebergewebe kann anhand der Aktivitätsniveaus der Marker für oxidativen Stress MDA, MPO und NO15 bestimmt werden. Das schwere ALD-Mausmodellsystem zeigte höhere oxidative Stresswerte in der Leber, was durch erhöhte Aktivitätsniveaus von MDA, MPO und NO im Vergleich zum ALD-Modell im Frühstadium angezeigt wird (Supp. Abb. S3a). Wir untersuchten auch die Leberaktivität endogener antioxidativer Enzyme, einschließlich CAT, GPx, GST und SOD15. Das schwere ALD-Mausmodellsystem zeigte im Vergleich zum ALD-Modell im Frühstadium geringere Leberaktivitätswerte von CAT, GPx, GST und SOD (Supp. Abb. S3b).

a Männliche C57BL/6 J-Mäuse wurden zufällig drei Versuchsgruppen zugeteilt (n = 6/Gruppe): (i) die Vehikelgruppe, die 6 Wochen lang mit Olivenöl, Intubation, 1 Woche Ruhe und 3 Wochen mit Olivenöl behandelt wurde; (ii) die EtOH-Gruppe (3 Wochen), die 6 Wochen lang mit Olivenöl, Intubation, einer einwöchigen Ruhepause und drei letzten Wochen mit intragastrischem EtOH behandelt wurde; und (iii) die CCl4 (9w)+EtOH-Gruppe wurde 6 Wochen lang mit CCl4 (0,2 ml/kg), Intubation, 1 Woche Ruhe und 3 Wochen lang mit einer niedrigeren CCl4-Dosis (0,1 ml/kg) und intragastrischem EtOH behandelt. Für experimentelle Analysen wurden Mäuse getötet. b, c Beurteilung der Serumtransaminase-Spiegel (ALT und AST). d–f Lebersteatose wurde durch Analyse der d Lebertriglyceridspiegel sowie e Oil Red O (ORO) und f Sirius Red-Färbung in fünf zufälligen 200-fachen Sichtfeldern quantifiziert. Maßstabsbalken = 200 μm. g Myeloperoxidase (MPO)-positive Zellen, quantifiziert aus fünf zufälligen 200-fachen Sichtfeldern. Maßstabsbalken = 200 μm. h Bewertung der zusammengesetzten Leberschädigungswerte. i Lebergewebe-RNA wurde für qPCR-Analysen von ABHD10 verwendet. HPRT1 wurde als Haushaltskontrolle verwendet. j ABHD10- und S-Palm-PRDX5-Proteinspiegel jeweils densitometrisch gemessen über Standard-Immunoblotting und Streptavidin-Pulldown-basiertes Immunoblotting von Lebergewebelysaten. Calnexin wurde als S-palmitoylierte Kontrolle und β-Actin als Beladungskontrolle verwendet. k Elk-3-Proteinspiegel, densitometrisch gemessen mittels Immunblotting von Lebergewebelysaten. Als Beladungskontrolle wurde β-Actin verwendet. l Lebergewebe-RNA wurde für qPCR-Analysen der Elk-3-Ziele EGR1, FOS und HIF1A verwendet. HPRT1 wurde als Haushaltskontrolle verwendet. Die Daten werden als Mittelwerte mit Standardabweichungen dargestellt. *P < 0,05, **P < 0,01 [einfaktorielle ANOVA].

Die mRNA- und Proteinexpression von Abhd10 war in Lebergewebeproben beider ALD-Modelle herunterreguliert, während S-palmitoyliertes Prdx5 hochreguliert war, wobei das schwere ALD-Modell tiefgreifendere Veränderungen aufwies (Abb. 3i, j). Konsistent war die Expression von Elk-3 und den Elk-3-Zielen Egr1, Fos und Hif1a in beiden ALD-Modellen verstärkt, wobei das schwere ALD-Modell tiefgreifendere Veränderungen aufwies (Abb. 3k, l). Daher sind die Herunterregulierung von Abhd10 und die Hochregulierung von S-palmitoyliertem Prdx5 mit ALD bei Menschen und Mäusen verbunden.

Als nächstes untersuchten wir, ob eine Abnahme der ABHD10-Expression in Hepatozyten mit einer Verringerung wichtiger biologischer Aktivitäten im Zusammenhang mit reifen Hepatozyten zusammenhängt, einschließlich synthetischer Aktivität, Stoffwechselfunktionalität und Gallensäurehomöostase. Um dies zu testen, verwendeten wir ein umfassend untersuchtes Modellsystem, in dem aus menschlichen Tumoren stammende hepatozytenähnliche Zellen einer Dedifferenzierung unterzogen werden16. Ursprünglich wurde 2 % DMSO verwendet, um menschliche, aus Tumoren stammende HepaRG-Zellen zwei Wochen lang zu behandeln, um sie in HepaRG-tdHep-Zellen zu differenzieren. Diese Zellen wurden dann unter dedifferenzierenden Bedingungen (dh geringer Konfluenz ohne DMSO) gezüchtet (Abb. 4a). Wie erwartet führte die Dedifferenzierung zu einer Hochregulierung von EMT-Markern und Vorläuferzell-bezogenen Genmarkern (Supp. Abb. S4). Bemerkenswerterweise war die Dedifferenzierung dieser Hepatozyten mit einer schnellen Herunterregulierung der ABHD10-mRNA- und -Proteinexpression sowie einer Hochregulierung von S-palmitoyliertem PRDX5 verbunden (Abb. 4b, c). Konsistent wurde die Expression von Elk-3 (Abb. 4d) und den Elk-3-Zielen EGR1, FOS und HIF1A (Supp. Abb. S5) durch Dedifferenzierung verstärkt.

a Nach der Differenzierung von HepaRG-Zellen in HepaRG-tdHep-Zellen über 2 % DMSO wurden HepaRG-tdHep-Zellen Dedifferenzierungsbedingungen unterzogen. Die Zellen wurden zu den Zeitpunkten 0 h (Grundlinie), 12 h und 24 h während der Dedifferenzierung (n = 9 biologische Replikate/Gruppe) für Analysen gesammelt. b ABHD10-Spiegel analysiert mittels qPCR. HPRT1 wurde als Haushaltskontrolle verwendet. c ABHD10- und S-Palm-PRDX5-Proteinspiegel, jeweils densitometrisch gemessen über Standard-Immunoblotting und Streptavidin-Pulldown-basiertes Immunoblotting. Calnexin wurde als S-palmitoylierte Kontrolle und β-Actin als Beladungskontrolle verwendet. d ELK-3-Proteinspiegel, densitometrisch mittels Immunblotting gemessen. Als Beladungskontrolle wurde β-Actin verwendet. e Ein Plasmid, das für die ABHD10-cDNA kodiert, oder ein leeres Kontrollplasmid (Ctrl) wurden in Hep3B-Zellen transfiziert (n = 9 biologische Replikate/Gruppe). 48 Stunden nach der Transfektion wurden Zellen gesammelt, um die ABHD10- und S-Palm-PRDX5-Proteinspiegel zu bestimmen. Calnexin wurde als S-palmitoylierte Kontrolle und β-Actin als Beladungskontrolle verwendet. f–k Plasmide, die für die ABHD10-shRNA (shABHD10), ABHD10-shRNA und PRDX5-cDNA (shABHD10 + PRDX5), ABHD10-shRNA und PRDX5-C100S-cDNA (shABHD10 + PRDX5C100S) oder leere Kontrollplasmide (Ctrl) kodieren, wurden in primäre menschliche Hepatozyten (PHH) transfiziert ) (n = 9 biologische Replikate/Gruppe). f Bewertung der ABHD10- und S-Palm-PRDX5-Proteinspiegel 48 Stunden nach der Transfektion. Calnexin wurde als S-palmitoylierte Kontrolle und β-Actin als Beladungskontrolle verwendet. g Transfizierte PHH-Zellen wurden 14 Tage lang mit Vehikel oder 25 mM EtOH + 2,5 μM B[a]P behandelt. Die ROS-Produktion wurde über den fluoreszierenden H2DCFDA-Farbstoff bewertet. Maßstabsbalken = 100 μm. h Die Expression von Leberstoffwechsel- und Gallensäuretransportgenen (ALB, BSEP, CYP7A1, CYP27A1, F7 und PCK1) wurde 48 Stunden nach der Transfektion mittels qPCR bewertet. HPRT1 wurde als Haushaltskontrolle verwendet. i Der Gesamtgallensäurespiegel in den Überständen wurde 48 Stunden nach der Transfektion quantifiziert. j Massenspektrometrie wurde verwendet, um die Glykochenodesoxycholatspiegel im Überstand zu bewerten, die 0 Stunden (Grundlinie), 12, 24 und 36 Stunden nach der Transfektion gesammelt wurden. k Die Glukoseproduktion wurde 48 Stunden nach der Transfektion quantifiziert. Die Daten werden als Mediane mit IQRs dargestellt, mit Ausnahme von Panel (g), das Mittelwerte mit SDs darstellt. *P < 0,05, **P < 0,01 [b–f, h, i, k U-Test; g zweifaktorielle ANOVA; und j wiederholte Messungen ANOVA].

Um die funktionelle Rolle von ABHD10 zu beurteilen, wurde eine Reihe von Hepatozytenfunktionsstudien in Hep3B- und PHH-Zellen nach Modulation der ABHD10-Expression durchgeführt. Die Überexpression von ABHD10 in Hep3B-Zellen (Supp. Abb. S6) war mit einer Herunterregulierung von S-palmitoyliertem PRDX5 verbunden (Abb. 4e). Umgekehrt führte der Abbau von ABHD10 in PHH-Zellen zu einem Anstieg von S-palmitoyliertem PRDX5, das durch ektopische Überexpression von WT-PRDX5 gerettet wurde, jedoch nicht durch ektopische Überexpression des nicht palmitoylierbaren, katalytisch inaktiven PRDX5-Mutanten PRDX5C100S8 beeinflusst wurde (Abb. 4f und Supp. Abb . S7a, b). Angesichts der bekannten Rolle der ABHD10-PRDX5-Achse bei der Regulierung der ROS-Erzeugung8 bremste ABHD10 die hochregulierte ROS-Produktion in PHH-Zellen, die durch ektopische Überexpression von WT PRDX5, jedoch nicht von PRDX5C100S, gerettet wurde (Abb. 4g). Darüber hinaus wurden durch den Knockdown von ABHD10 synthetische, sekretorische und metabolische funktionsbezogene Gene (z. B. ALB, BSEP, CYP7A1, CYP27A1, F7 und PCK1) in PHH-Zellen herunterreguliert, die alle durch ektopische Überexpression von WT PRDX5, nicht jedoch von PRDX5C100S, gerettet wurden (Abb . 4h). Der Abbau von ABHD10 verringerte auch die Gallensäuresynthese, die Bildung von Glycochenodesoxycholat-konjugierter Gallensäure und die Glukoseproduktion in PHH-Zellen, die alle durch ektopische Überexpression von WT PRDX5, jedoch nicht von PRDX5C100S, gerettet wurden (Abb. 4i – k). Zusammen hemmt ABHD10 oxidativen Stress und verbessert die biologische Funktion reifer Hepatozyten, indem es S-palmitoyliertes PRDX5 herunterreguliert.

Als nächstes versuchten wir, die vorgelagerten Mechanismen zu bewerten, die die Fehlregulation von ABHD10 und S-palmitoyliertem PRDX5 im Zusammenhang mit AH-bedingtem Leberversagen steuern. Zuvor veröffentlichte transkriptomische Analysen von Leberproben von AH-Patienten haben den transformierenden Wachstumsfaktor β1 (TGFβ1) und den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) als zwei wichtige vorgelagerte Regulatoren der AH-Progression hervorgehoben17. Dementsprechend stellten wir fest, dass Leberproben von AH-Patienten eine Hochregulierung von TGFβ1, seinen beiden primären Rezeptoren (1 und 2) und dem EGFR-Liganden Amphiregulin (AREG) aufwiesen (Supp. Abb. S8a – d). Wir gingen davon aus, dass TGFβ1 und/oder AREG die Expression von ABHD10 und S-palmitoyliertem PRDX5 in Hepatozyten regulieren könnten. Tatsächlich stellten wir fest, dass die ABHD10-mRNA- und -Proteinspiegel nach TGFβ1- oder AREG-Behandlung in Hep3B-Zellen abnahmen, während S-palmitoyliertes PRDX5 anstieg (Abb. 5a, b). Als nächstes versuchten wir festzustellen, ob der Einfluss der TGFβ1- oder AREG-Behandlung auf die Hochregulierung von S-palmitoyliertem PRDX5 tatsächlich durch die Herunterregulierung von ABHD10 bedingt war. Wenn ein ABHD10-Überexpressionsvektor in Hep3B-Zellen transfiziert wurde (Supp. Abb. S9), hob die ABHD10-Überexpression die TGFβ1- oder AREG-induzierte S-palmitoylierte PRDX5-Hochregulation auf (Abb. 5c). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass der Einfluss von TGFβ1 und AREG auf ABHD10 TGFβ1R1-abhängig (Abb. 5d) bzw. EGFR-abhängig (Abb. 5e) ist. Die MEK/ERK-Signalisierung war für die ABHD10-Dysregulation nach TGFβ1 oder AREG erforderlich (Abb. 5f, g).

Nach dem Serummangel über Nacht wurden Hep3B-Zellen 8 Stunden lang TGFβ1 (5 ng/ml) und/oder 12 Stunden lang AREG (50 nM) ausgesetzt, sofern angegeben (n = 9 biologische Replikate/Gruppe). a, b Hep3B-Zellen wurden TGFβ1 und/oder AREG ausgesetzt. a ABHD10-Werte, analysiert mittels qPCR. HPRT1 wurde als Haushaltskontrolle verwendet. b ABHD10- und S-Palm-PRDX5-Proteinspiegel, jeweils densitometrisch gemessen mittels Standard-Immunblotting und Streptavidin-Pulldown-basiertem Immunblotting. Calnexin wurde als S-palmitoylierte Kontrolle und β-Actin als Beladungskontrolle verwendet. c 48 Stunden nach der Transfektion mit einem Plasmid, das die ABHD10-cDNA oder das leere Kontrollplasmid (Ctrl) kodiert, und der Behandlung mit TGFβ1, ABHD10 und S-Palm-PRDX5-Proteinspiegel wurden jeweils densitometrisch mittels Standard-Immunblotting und Streptavidin-Pulldown-basiertem Immunblotting gemessen. Calnexin wurde als S-palmitoylierte Kontrolle und β-Actin als Beladungskontrolle verwendet. Die ABHD10-Expression wurde mittels qPCR wie folgt beurteilt: d Vorbehandlung mit SB431542 (5 nM) zur Hemmung von TGFβ-RI und Behandlung mit TGFβ1; e 12-stündige Vorbehandlung mit PD153035 (25 μM) zur Hemmung von EGFR und Behandlung mit AREG; f, g Vorbehandlung mit U0126 (10 µM) zur Hemmung der MEK/ERK-Aktivität und Behandlung mit f TGFβ1 oder g AREG; und h, i Vorbehandlung mit siELK3 zum Abbau von ELK-3 und Behandlung mit h TGFβ1 oder i AREG. HPRT1 wurde als Haushaltskontrolle verwendet. j Nach der TGFβ1- und/oder AREG-Behandlung wurde ChIP unter Verwendung von Kontroll-IgG oder einem für ELK-3 spezifischen Antikörper der ChIP-Qualität durchgeführt. Die ABHD10-Promotorregion (links) und die GAPDH-Promotorregion (rechts) wurden mittels qPCR bewertet, wobei die Daten in Form einer ELK-3-Anreicherung im Vergleich zum Kontroll-IgG angezeigt wurden. Die Daten werden als Mediane mit IQRs dargestellt, mit Ausnahme von Panel (j), das Mittelwerte mit SDs darstellt. *P < 0,05, **P < 0,01 [a–i U-Test und j Zwei-Wege-ANOVA].

Es wurde gezeigt, dass ELK-3 ein Downstream-Mediator von TGFβ1 und der RAS/MAPK-Signalisierung ist7. Hier störte der Abbau von ELK-3 die Fähigkeit von TGFβ1 oder AREG, die Herunterregulierung der ABHD10-mRNA zu fördern (Abb. 5h, i). Unter Verwendung der oben beschriebenen konservierten ELK-3-Bindungsstelle auf dem ABHD10-Promotor wurden dann für ELK-3 spezifische Antikörper zur Durchführung von ChIP verwendet. Nach der Behandlung mit TGFβ1 oder AREG beobachteten wir eine stärkere Bindung von ELK-3 an die Region, die die konservierte ELK-3-Stelle enthielt (Abb. 5j). TGFβ1 oder AREG können daher die Rekrutierung von ELK-3 in der ABHD10-Promotorregion induzieren. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die Herunterregulierung von ABHD10 und die Hochregulierung von S-palmitoyliertem PRDX5 mit der TGFβ1- oder AREG-Signalisierung über ELK-3 verbunden sind.

Da PPARγ die TGFβ1-Signalübertragung18 hemmt, untersuchten wir als nächstes die Fähigkeit des PPARγ-Agonisten Rosiglitazon, der durch TGFβ1 induzierten ABHD10-Herunterregulierung entgegenzuwirken. Rosiglitazon rettete die Herunterregulierung der ABHD10-mRNA unter TGFβ1-Bedingungen (Supp. Abb. S10a). Darüber hinaus zeigte Rosiglitazon einen dosisabhängigen Einfluss auf die ABHD10-mRNA-Expression (Supp. Abb. S10b). Da Rosiglitazon der TGFβ1-induzierten Herunterregulierung von ABHD10 entgegenwirken kann, könnte dies einen Mechanismus darstellen, durch den PPARγ-Agonisten in experimentellen Modellen von ALD19 eine vorteilhafte Aktivität zeigen.

Um die therapeutischen Wirkungen von Abhd10 in vivo zu bestimmen, führten wir eine rAAV-basierte Abgabe des Abhd10-Gens an unsere ALD-Mausmodelle im frühen und fortgeschrittenen Stadium durch (Abb. 6a). Die mRNA- und Proteinexpression von Abhd10 wurde überexprimiert, während S-palmitoyliertes Prdx5 nach der Abgabe von rAAV.Abhd10 in beiden ALD-Modellen herunterreguliert wurde (Abb. 6b). Wie erwartet zeigte das schwere ALD-Mausmodellsystem (d. h. CCl4 für neun Wochen, gefolgt von EtOH unter HFD-Bedingungen) eine ausgeprägtere Leberschädigung und oxidativen Stress im Vergleich zum ALD-Modell im Frühstadium (d. h. EtOH für drei Wochen unter HFD-Bedingungen). (Abb. 6c–j und Supp. Abb. S11a, b). Leberschäden, Hepatozytensteatose und oxidativer Stress im ALD-Modell im Frühstadium wurden durch die Abgabe von rAAV.Abhd10 verbessert (Abb. 6c – j und Supp. Abb. S11a, b). Darüber hinaus wurden die Leberschäden, die perizelluläre Fibrose und der oxidative Stress im schweren ALD-Mausmodellsystem auch durch die Verabreichung von rAAV.Abhd10 gelindert (Abb. 6c – j und Supp. Abb. S11a, b). Angesichts der positiven Auswirkungen der Verabreichung von rAAV.Abhd10 auf die Linderung alkoholbedingter Leberschäden bei Mäusen könnte sich ABHD10 als vielversprechendes Ziel für therapeutische Interventionen bei ALD erweisen.

a Männliche C57BL/6 J-Mäuse erhielten intraperitoneale Injektionen mit rAAV.Ctrl oder rAAV.Abhd10. Die Mäuse wurden dann zufällig in sechs Versuchsgruppen eingeteilt (n = 6/Gruppe): (i, ii) die Vehikelgruppen, die 6 Wochen lang mit Olivenöl, Intubation, 1 Woche Ruhe und 3 Wochen mit Olivenöl behandelt wurden; (iii, iv) die EtOH (3w)-Gruppen, die 6 Wochen lang mit Olivenöl, Intubation, 1 Woche Ruhe und 3 letzten Wochen mit intragastrischem EtOH behandelt wurden; und (v, vi) die CCl4 (9w)+EtOH-Gruppen, die 6 Wochen lang mit CCl4 (0,2 ml/kg), Intubation, 1 Woche Ruhe und 3 Wochen lang mit einer niedrigeren CCl4-Dosis (0,1 ml/kg) und intragastrisch behandelt wurden EtOH. Für experimentelle Analysen wurden Mäuse getötet. b Lebergewebe-RNA wurde für qPCR-Analysen von ABHD10 verwendet. HPRT1 wurde als Haushaltskontrolle verwendet. c ABHD10- und S-Palm-PRDX5-Proteinspiegel jeweils densitometrisch gemessen mittels Standard-Immunblotting und Streptavidin-Pulldown-basiertem Immunblotting von Lebergewebelysaten. Calnexin wurde als S-palmitoylierte Kontrolle und β-Actin als Beladungskontrolle verwendet. d, e Bewertung der Serumtransaminase-Spiegel (ALT und AST). f–h Lebersteatose wurde durch Analyse der f hepatischen Triglyceridspiegel sowie g Oil Red O (ORO) und h Sirius Red-Färbung quantifiziert. Maßstabsbalken = 200 μm. i Myeloperoxidase (MPO)-positive Zellen, quantifiziert aus fünf zufälligen 200-fachen Sichtfeldern. Maßstabsbalken = 200 μm. j Bewertung der zusammengesetzten Leberschädigungswerte. Die Daten werden als Mittelwerte mit SDs dargestellt, mit Ausnahme der Panels (b, c), die Mediane mit IQRs darstellen. *P < 0,05, **P < 0,01 [b, c U-Test und d–j Zwei-Wege-ANOVA].

Hepatotoxische Schäden sind durch zelluläre und metabolische Veränderungen gekennzeichnet, die oxidativen Stress auslösen20,21. Beispielsweise verbraucht der Ethanolstoffwechsel in Leberzellen Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+), wodurch das NADH/NAD+-Verhältnis erhöht und die mitochondriale ROS-Erzeugung vorangetrieben wird, einschließlich Singulettsauerstoff, Superoxid (O2·−), Hydroxyethylradikalen und Ethoxyradikalen22. Da übermäßige ROS schädlich für Leberzellen sind, lindert die Kontrolle des oxidativen Stressniveaus Lebererkrankungen in ALD-Modellen23,24 und anderen Tiermodellen für hepatoxische Schäden25,26. Peroxiredoxine (PRDXs, PRXs) sind eine große Familie thiolabhängiger Peroxidasen, die mtROS durch ihre konservierten Cysteinreste reduzieren27. Unter den sechs bekannten Säugetier-PRDX-Isoformen (PRDX1-6) ist PRDX5 ein atypisches 2-Cystein-PRDX (Cys100/Cys204) mit einer bekannten zytoprotektiven Rolle, breiter Substratspezifität (z. B. H2O2, Alkylhydroperoxide und Peroxynitrit) und weite subzelluläre Verteilung28 (z. B. Mitochondrien, Zytoplasma und Zellkern). Dementsprechend wurde gezeigt, dass die Überexpression von adenoviralem Prdx5 bei Mäusen durch oxidativen Stress verursachte Leberschäden (z. B. Hepatozyten-Ballonbildung, Endothelzellschädigung und sinusförmige Stauung) reduziert und das Gesamtüberleben bei kleinen Lebertransplantatempfängern verbessert29. Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, dass eine Verbesserung der PRDX5-Aktivität der Hepatozyten positive Auswirkungen auf die Hepatotoxizität haben kann.

Die PRDX-Aktivität wird durch eine Vielzahl von Posttranslationsmodifikationen reguliert, darunter Hyperoxidation, Cysteinglutathionylierung, Cysteinnitrosylierung, Tyrosin/Threonin-Phosphorylierung und Lysinacetylierung27. S-Palmitoylierung, die reversible Addition einer gesättigten C16-Lipidpalmitat-Einheit an das Schwefelatom von Cystein über eine Thioesterbindung, ist die häufigste Form der Cystein-Acylierung bei Säugetieren30,31,32. S-Palmitoylierung beeinflusst die Stabilität, Aktivität, Lokalisierung und den Transport des Zielproteins33,34,35 und S-Palmitoylierung scheint bei zahlreichen Krankheitszuständen eine Rolle zu spielen36,37,38. Die S-Palmitoylierung wird dynamisch durch die S-Palmitoylator-Protein-Acyltransferasen und die De-S-Palmitoylator-Acyl-Protein-Thioesterasen reguliert. Obwohl die meisten Acylproteinthioesterasen hauptsächlich im Zytoplasma, in Lysosomen und im Golgi-Apparat lokalisiert sind, haben Cao et al. entdeckten, dass die Acylproteinthioesterase ABHD10 ausschließlich in den Mitochondrien lokalisiert ist und die PRDX5-Aktivität durch De-S-Palmitoylierung ihres aktiven Zentrums Cys100 8 fördert. In Übereinstimmung mit dem biochemischen Modell von Cao et al. fanden wir heraus, dass ABHD10 oxidativen Stress hemmt und die Reifung fördert Hepatozytenfunktion über PRDX5-De-S-Palmitoylierung an seinem Cys100-Rest. Darüber hinaus wurden die ABHD10-Transaktivierung und die daraus resultierende PRDX5-De-S-Palmitoylierung durch die TGFβ1- und EGF-Signalwege negativ reguliert, die zuvor mit hepatotoxischen Schäden und Fibrose in Verbindung gebracht wurden 39 . Dies steht im Einklang mit früheren Untersuchungen, die eine durch Wachstumsfaktoren vermittelte Regulierung anderer Acylproteinthioesterasen zeigten40. Durch die Anwendung dieses Wissens in vivo konnten wir auch zeigen, dass die ektope Überexpression von Abhd10 Leberschäden bei ALD-Modellmäusen lindert. Diese kombinierten Beweise legen nahe, dass eine Verbesserung der ABHD10-Expression in Hepatozyten und die daraus resultierende PRDX5-De-S-Palmitoylierung positive Auswirkungen auf hepatotoxische Verletzungen und Fibrose haben können.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Lebergewebe von SAH-Patienten und ALD-Mäusen eine Hochregulierung der ELK-3-Expression und der ELK-3-Signalaktivität in Verbindung mit einer Herunterregulierung von ABHD10 und einer Hochregulierung der deaktivierenden S-Palmitoylierung von PRDX5 aufweisen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass TGFβ1 und AREG über ELK-3 eine Herunterregulierung von ABHD10 und eine Hochregulierung von S-palmitoyliertem PRDX5 in Hepatozyten induzieren, was letztendlich zu oxidativem Stress führt und die Funktion reifer Hepatozyten stört. In vivo verbesserte die ektope Überexpression von Abhd10 den Leberschaden bei ALD-Modellmäusen. Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Bemühungen zur gezielten Ausrichtung auf die ABHD10-PRDX5-Achse für die Behandlung von ALD und anderen Formen der Hepatotoxizität von Nutzen sein könnten.

Alle menschlichen Protokolle wurden im Voraus von der Ethikkommission des angegliederten Krankenhauses der Universität Chifeng (Genehmigungsnummer fsyy202005; Chifeng, China) genehmigt und gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Vor der Gewebeprobenentnahme wurde von allen menschlichen Teilnehmern eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

Alle Tierprotokolle wurden im Voraus von der Ethikkommission des College of Basic Medical Science der Chifeng-Universität genehmigt (Genehmigungsnummer jcyxy202008; Chifeng, China) und entsprachen den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) für die Pflege und Verwendung von Labortiere (Bethesda, MD).

Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Microarray-Daten zu menschlichen Lebergewebeproben aus SAH (n = 15) und normalen Lebern (n = 7) wurden aus der GEO-Datenbank (GEO-Zugangsnummer: GSE28619) heruntergeladen. Die klinischen Merkmale wurden in der Quellenstudie11 detailliert beschrieben. Das Paket „Co-Expression Modules Identification Tool“ (CEMiTool) in R nutzt eine auf der inversen Gammaverteilung basierende unbeaufsichtigte Filtermethode, um Gene aus der Quell-Genexpressionsdatei auszuwählen41. Zur Bestimmung eines Ähnlichkeitskriteriums zwischen Genpaaren wurde eine Soft-Thresholding-Leistung von β = 9 verwendet, und die Gene wurden mithilfe des Dynamic Tree Cut-Pakets in Koexpressionsgenmodule aufgeteilt. Mithilfe einer Gen-Set-Anreicherungsanalyse wurden die Genmodule sichtbar gemacht, die im SAH und im normalen Phänotyp induziert oder unterdrückt werden. Modulnetzwerkdiagramme, die interagierende Gene anzeigen, basierten auf der BioGRID Homo sapiens-Interaktionsdatei. Eine Reaktom-basierte Überrepräsentationsanalyse über das ClusterProfiler R-Paket wurde verwendet, um die Signalweganreicherung für jedes Modul zu identifizieren und einzustufen. Das Limma-Paket in R wurde verwendet, um die unterschiedliche Genexpression zu bewerten. Lineare Regressionsanalysen für DEGs wurden unter Verwendung der lm-Funktion in R durchgeführt. Reaktomanreicherungsanalysen unter Verwendung des pathFindR-Pakets in R43 wurden verwendet, um die Signalweganreicherung für signifikant korrelierende DEGs zu identifizieren und einzustufen. Die Promotorregion für das ABHD10-Gen (NM_018394) (d. h. 1000 bp stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle [TSS chr3:111697827]) wurde nach vier Schlüsselmotiven des ELK-3-Transkriptionsfaktors durchsucht (d. h. M01982 [TRANSFAC20113], ACCGGAAGTN-Elk3 -DBD [taipale], M6208_1.02 und MA0759.1 [JASPAR_CORE_2016]) mit Contra v344-Tool (Stringenzparameter: Kern = 0,95, Ähnlichkeitsmatrix = 0,85).

Vollblut- und Leberbiopsieproben wurden von AH-Patienten (n = 10) und demografisch passenden gesunden Kontrollpersonen (n = 10) im angegliederten Krankenhaus der Chifeng-Universität (Chifeng, China) entnommen. Die klinisch-demografischen Merkmale dieser menschlichen Gewebespender sind in Supp detailliert beschrieben. Tabelle S1. Alle AH-Patienten hatten eine klinisch und histologisch bestätigte Diagnose von AH und wurden vor jeder Behandlung einer Leberbiopsie unterzogen. Gesunde Kontrollspender hatten keinen Alkoholmissbrauch in der Vorgeschichte und bei allen gesunden Kontrollleberproben wurde histologisch bestätigt, dass sie krankheitsfrei waren. Personen mit einer Vorgeschichte von bösartigen Erkrankungen, einer nichtalkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) nach Kleiners Kriterien45 oder einer HCV-Infektion wurden von der Kandidatur ausgeschlossen. Im Studiendesign wurden weder Geschlecht noch Gender berücksichtigt.

Die Blutproben wurden auf Serumalbumin, Serum-Gesamtbilirubin und internationale Tests untersucht

Normalisierte Verhältnisanalysen (INR) unter Verwendung herkömmlicher Protokolle. Lebergewebeproben wurden wie unten beschrieben einer qPCR, einer immunhistochemischen Färbung und einer Western-Blot-Analyse unterzogen.

Die Mäuse wurden in einer klimatisierten Einrichtung (12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Männliche C57BL/6-Mäuse (6 Wochen alt) wurden von der Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. (Peking, China) erhalten. Wie zuvor berichtet, wurden Modelle für akute oder chronische Leberschäden bei männlichen C57BL/6-Mäusen (12 Wochen alt, 20–25 g) etabliert46. Olivenöl (Fahrzeugkontrolle; AGRIC, Griechenland), CCl4 (Reinheit >99,5 %, Sigma) und 190-prozentiges (95 %) EtOH wurden verwendet, um Leberschäden auszulösen, wie in einer früheren Studie beschrieben17. Kurz gesagt, die Mäuse wurden per Zufallszahlengenerator in drei experimentelle Kohorten randomisiert: Vehikel, EtOH (3w) und CCl4 (9w) + EtOH. Den Tieren der Vehikelkohorte und der EtOH (3w)-Kohorte wurde intraperitoneal (ip) Olivenöl (10 ml/kg) injiziert, während den Tieren der CCl4 (9w)+EtOH-Kohorte ip CCl4 (0,2 ml/kg in 10 ml/kg Olivenöl) injiziert wurde Öl), zweimal wöchentlich über einen Zeitraum von 6 Wochen. Am Ende der sechsten Woche wurden alle Tiere intragastrisch intubiert, einzeln in Stoffwechselkäfigen gehalten und erhielten eine einwöchige Erholungsphase mit freiem Zugang zu Futter und Wasser. Anschließend durften alle Tiere in den letzten drei Wochen frei Wasser und nicht nahrhafte Zellulosepellets zu sich nehmen. Den Tieren der Vehikelkohorte und der EtOH (3w)-Kohorte wurde intraperitoneal (ip) Olivenöl (10 ml/kg) injiziert, während der CCl4 (9w)+EtOH-Kohorte ip CCl4 (0,1 ml/kg in 10 ml/kg Olivenöl) injiziert wurde ), zweimal wöchentlich über den Zeitraum von 3 Wochen. Während des gleichen letzten dreiwöchigen Zeitraums wurde den Tieren der EtOH (3w)-Kohorte und der CCl4 (9w)+EtOH-Kohorte eine fettreiche Diät (HFD) mit EtOH-Ergänzung verabreicht, wobei regelmäßig Alkohol verabreicht wurde (16 g/kg/Tag). ) zunächst über eine intragastrische Kanüle verabreicht, wobei diese Rate schrittweise auf 25 g/kg/Tag erhöht wird. Die Toleranzentwicklung wurde anhand der Alkoholintoxikation beurteilt. Am Endpunkt der Studie wurde Pentobarbital (50 mg/kg, ip) verwendet, um Mäuse zu betäuben und Blut zu sammeln. Nach der Entnahme wurde flüssiger Stickstoff zum Einfrieren der Gewebe verwendet.

Die Kassette mit verstärktem grün fluoreszierendem Protein (eGFP) wurde aus einem rAAV2-Plasmid unter der Kontrolle des leberspezifischen Promotors 1 (rAAV2-pLSP1-eGFP) herausgeschnitten, um das rAAV2-pLSP1-Vektorrückgrat zu erhalten47. Die murine Abdh10-cDNA (NM_172511; #MC203394, Origene) wurde PCR-amplifiziert und in das rAAV2-pLSP1-Rückgrat kloniert, um rAAV.Abhd10 zu bilden, während der leere rAAV2-pLSP1-Vektor als Negativkontrolle (rAAV.Ctrl) verwendet wurde. Da rekombinante AAV-Typ-8-Vektoren (rAAV8) unter den rAAV-Vektoren den ausgeprägtesten Lebertropismus bei Mäusen aufweisen48, wurden die Vektoren rAAV.Ctrl oder rAAV.Abhd10 mit rAAV8 durch Calciumphosphattransfektion mit pXX680 und p5E18-VD2/8 pseudoserotypisiert. Die rAAV.Ctrl- oder rAAV.Abhd10-Partikel wurden in HEK293-Zellen hergestellt und anschließend gereinigt und titriert48. Zur Hepatozyten-spezifischen Genabgabe wurde Mäusen rAAV.Ctrl oder rAAV.Abhd10 intraperitoneal injiziert.

Die Serumspiegel von Aspartataminotransferase (AST), Alaninaminotransferase (ALT), Albumin und Gesamtbilirubin wurden mit ihren jeweiligen biochemischen Kits (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, China) analysiert. Der Triglyceridspiegel in der Leber wurde mit einem Triglycerid-Assay-Kit (Solarbio, Peking, China) bestimmt. Die Aktivitätswerte der Myeloperoxidase (MPO) in Leberhomogenatproben wurden mit einem ELISA-Kit (Jiancheng Institute of Biotechnology) bewertet. Die Konzentrationen von Malondialdehyd (MDA) und Stickoxid (NO) in Leberhomogenatproben wurden mit den jeweiligen kolorimetrischen Kits (Jiancheng Institute of Biotechnology) bestimmt. Antioxidantienmarkerspiegel in Leberhomogenatproben (nämlich Katalase (CAT), Glutathionperoxidase (GPx), Glutathion-S-Transferase (GST) und Superoxiddismutase (SOD)) wurden mit ihren jeweiligen Kits (Cayman Chemicals Co.) untersucht.

Die Sirius-Red-Färbung erfolgte durch Entparaffinierung von 5-µm-Schnitten und anschließende Färbung mit Sirius-Red sowie Hämatoxylin und Eosin. Die Ölrot-O-Färbung wurde durchgeführt, indem Gewebe mit einer Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur eingebettet und 10-µm-Gewebeschnitte vorbereitet wurden. Zur Quantifizierung der Ergebnisse der Oil Red O- und Sirius Red-Färbung wurde die ImageJ-Software (NIH) verwendet, wobei pro Probe zehn zufällige Sichtfelder mit 100-facher Vergrößerung analysiert wurden. Hämatoxylin und Eosin wurden zum Färben entparaffinierter 3-µm-Schnitte basierend auf Standard-Färbeprotokollen verwendet. Zwei zugelassene Pathologen analysierten die hepatische Histopathologie blind49.

Die immunhistochemische Färbung erfolgte durch Entparaffinierung und Rehydratisierung von 3-µm-Schnitten, gefolgt von 40-minütiger Mikrowellenerhitzung in Tris-EDTA (pH 6,0) zur Antigengewinnung. Nach der 10-minütigen Peroxidaseblockierung mit REAL (Dako) wurden die Schnitte 60 Minuten lang einem Anti-ABHD10-Antikörper (1:20, #PA5-57905, Thermo) ausgesetzt. Die Antikörperfärbung wurde mit dem REAL EnVision Detection System (Dako, Japan) entwickelt. Anschließend wurde Hämatoxylin zur Gegenfärbung und Immu-Mount (Thermo) zum Einbetten der Proben verwendet. Zwei zugelassene Pathologen überprüften und bewerteten alle gefärbten Proben blind. Zur Bewertung der immunhistochemischen Färbung wurde ein semiquantitativer Ansatz verwendet, der auf einer Skala von 0–3 basierte.

Primäre menschliche Hepatozyten (PHH, Lonza) wurden in von Lonza gekauften Medien hergestellt und kultiviert, darunter Auftaumedien (MCHT), Plattierungsmedien (MP) und Erhaltungsmedien (MM), die zum Auftauen, Ausplattieren und Kultivieren verwendet wurden diese Zellen bzw. Nach 4-stündiger Anlagerung an Kollagen-beschichtete Platten mit 6 oder 12 Vertiefungen (Corning) wurde Matrigel (0,3 mg/ml; Corning) auf die Kulturoberfläche aufgetragen. Für Knockdown-Experimente auf der Basis von Small-Interfering-RNA (siRNA) wurde die Matrigel-Überlagerung 6 Stunden nach der siRNA-Transfektion durchgeführt, wobei die Zellen während dieses 6-Stunden-Zeitraums in OptiMEM (Gibco) mit niedrigem Serumgehalt kultiviert wurden. Zellen und Überstände wurden zu den angegebenen Zeiten gesammelt.

Mykoplasmenfreie Hep3B-Zellen (ATCC) wurden in DMEM (Gibco) kultiviert, das 10 % FBS (Gibco) und Penicillin/Streptomycin (Gibco) enthielt. Für Experimente mit medikamentöser Behandlung wurden die Zellen einem Serummangel unterzogen, indem sie vor der Arzneimittelexposition 2 Stunden lang in DMEM mit 1 % FBS kultiviert wurden. Für Knockdown- und Überexpressionstests wurde die Behandlung 48 Stunden nach der Transfektion begonnen, wobei die Zellen zunächst 6 Stunden nach der Transfektion in OptiMEM kultiviert wurden, gefolgt von einer Kultur in DMEM mit 1 % FBS bis zur anschließenden Sammlung.

Mykoplasmenfreie HepaRG-Zellen (Thermo), eine immortalisierte Leberzelllinie, wurden in Williams-E-Medien mit 10 % FBS, Insulin (5 μg/ml), Hydrocortisonhemisuccinat (50 μM) und Penicillin/Streptomycin kultiviert. Nach einer anfänglichen zweiwöchigen Kulturperiode wurde diesem Kulturmedium 2 % DMSO zugesetzt und die Zellen wurden zwei weitere Wochen lang kultiviert. Für Analysen der Hepatozyten-Dedifferenzierung wurden HepaRG-Zellen in geringer Dichte auf Platten geerntet, ohne dass DMSO im Kulturmedium enthalten war50.

Die siRNAs waren wie folgt: Silencer Select Negative Control No. 1 siRNA (#4390843, Thermo), Silencer Select siRNA gegen ABHD10 (#4392420, Thermo) und Silencer Select siRNA gegen ELK3 (#4390771, Thermo). Für PHH-Zellen und Hep3B-Zellen wurden siRNAs in jeweiligen Arbeitskonzentrationen von 20 pM und 10 pM verwendet. Lipofectamine-RNAiMAX (Invitrogen) wurde verwendet, um siRNAs in Zellen zu transfizieren. Die Experimente wurden 48 Stunden nach der Transfektion durchgeführt.

Zur Überexpression von ABHD10 wurde der menschliche ABHD10-Klon (NM_018394, SC319244, Origene) unter der Kontrolle eines CMV-Promotors in einen pcDNA6-Vektor (Invitrogen) kloniert. Für den ABHD10-Knockdown mit oder ohne Rettungsüberexpression von WT PRDX5 oder der nicht handhabbaren, katalytisch inaktiven PRDX5-Mutante PRDX5C100S wird ein modifizierter pcDNA6-Vektor verwendet, der eine ABHD10-shRNA (unter der Kontrolle eines U6-Promotors) enthält, kombiniert mit einer Überexpressionskassette, die eine durcheinandergemischte Kontroll-cDNA enthält. Es wurde PRDX5-cDNA oder die PRDX5C100S-cDNA (unter der Kontrolle eines CMV-Promotors und einer internen ribosomalen Eintrittsstelle) konstruiert51. Zur Transfektion von Plasmiden wurde Lipofectamine 3000 (Invitrogen) verwendet. Die Experimente wurden 48 Stunden nach der Transfektion durchgeführt.

Die ROS-Erzeugung wurde mit B[a]P und EtOH getestet, wie zuvor in Lit. beschrieben. 52. Kurz gesagt, PHH-Zellen wurden 2 Tage lang in MM kultiviert und dann 14 Tage lang alle zwei Tage mit B[a]P (2,5 μM in MM) plus EtOH (25 mM in MM) oder Vehikel behandelt. Vierundzwanzig Stunden nach der letzten B[a]P+EtOH-Behandlung wurde die ROS-Erzeugung mithilfe des H2DCFDA-Farbstoffs bewertet, um die Wasserstoffperoxiderzeugung mithilfe eines SpectraMax M2-Plattenlesegeräts (Molecular Devices) mit Anregungs-/Emissionswellenlängen von 485/520 nm zu erfassen. Die Werte der Fluoreszenzintensität wurden auf den Gesamtproteingehalt normalisiert. Zur Aufnahme von Bildproben wurde ein inverses Epifluoreszenzmikroskop verwendet.

PHH-Zellen wurden zu 96-Well-Kollagen-beschichteten Platten in MM (Lonza) gegeben (2 × 104/Well), mit den angegebenen siRNAs transfiziert und nach 48 Stunden gesammelt. Zur Messung des Gallensäuregehalts wurde ein Gesamtgallensäure-Assay-Kit (Cell Biolabs) mit einem SpectraMax M2-Plattenlesegerät (Molecular Devices) verwendet. Zur Messung des Gesamtgallensäurespiegels in einzelnen Proben wurde eine Kalibrierungskurve verwendet.

Der Glycochenodesoxycholatspiegel wurde mittels Massenspektroskopie53 quantifiziert. Kurz gesagt, 50 μl kultivierte PHH-Zellen und 100 μl Acetonitril wurden gevortext, 2,5 Minuten lang bei 22.0000 × g zentrifugiert und die Überstände wurden zehnfach in einer Lösung von Acetonitril in Wasser (1:4) verdünnt, gefolgt von LC-MS /MS-Analyse. Eine Standardkurve (1–10.000 nM) wurde mit Glykochenodesoxycholat (Sigma) erstellt, wobei lineare Regressionsanalysen zur Quantifizierung der Glykochenodesoxycholatkonzentrationen in den Medien verwendet wurden.

PHH-Zellen wurden 24 Stunden lang in MM zu mit Kollagen beschichteten Platten mit 12 Vertiefungen gegeben (1 × 105/Vertiefung), danach wurden sie über Nacht einem Serummangel in DMEM unterzogen, das Glucose (1 g/l), L-Glutamin ( 4 mM) und Natriumbicarbonat (3,7 g/l). Die Proben wurden dann in 300 µl Glukoseproduktionsmedium inkubiert, das durch Kombination von DMEM mit Natriumbicarbonat (3,7 g/l), HEPES (15 mM, ThermoFisher), Laktat (20 mM, Sigma), Glutamin (2 mM) hergestellt wurde. , Pyruvat (2 mM, Fisher) und pCPT-cAMP (0,1 mM, Sigma) (67,68). Nach einer 24-stündigen Inkubation wurden die Glucosespiegel in 50 μl Medium mit einem Glucose Colorimetric Detection Kit (EIAGLUC, Invitrogen) bestimmt. Die Zellen wurden vor der Kultivierung gründlich gewaschen, so dass die kultivierten Hepatozyten die einzige potenzielle Glucosequelle in diesen Überständen waren.

Für entsprechende Experimente wurden die Zellen unmittelbar vor der Matrigel-Anwendung mit Amphiregulin (AREG, 50 nM, Sigma-Aldrich) oder TGFβ1 (5 ng/ml, R&D Systems) behandelt. Für die Inhibitionsexperimente wurden die Zellen 2 Stunden lang in DMEM mit 1 % FBS kultiviert, bevor der TGFβRI-Inhibitor SB431542 (5 nM, Calbiochem-EMD Millipore), der EGFR-Inhibitor PD153035 (3 μM, Calbiochem-EMD Millipore) und der MEK-Inhibitor UO126 (10 μM, Promega) oder Rosiglitazon (10 μM, Sigma), gefolgt 45 Minuten später von der Behandlung mit AREG (50 nM) oder TGFβ1 (5 ng/ml), wie angegeben.

Zur Gewinnung von RNA aus Gewebeproben wurde das AllPrep DNA/RNA/Protein-Kit (Qiagen) verwendet. TRIzol-Reagenz (Invitrogen) wurde verwendet, um RNA aus Zellen in Kultur über einen Phenol/Chloroform-Ansatz zu sammeln. Zur Messung der RNA-Menge und -Reinheit wurde ein Nanodrop-Gerät (Thermo) eingesetzt. Anschließend wurde die RNA (1 μg) mit einem Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit für RT-qPCR mit dsDNase (Thermo) revers transkribiert. Alle qPCR-Assays wurden in einem 96-Well-Plattenformat mit 50 ng cDNA pro Reaktion durchgeführt. Für alle qPCR-Assays wurden der SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) und ein CFX96 Real-Time PCR-Gerät (Bio-Rad) verwendet. Die Primersequenzen sind in Supp aufgeführt. Tabelle S2. Die 2−ΔΔCt-Methode wurde verwendet, um die relative Genexpression unter Verwendung von HPRT1 zur Normalisierung zu vergleichen54.

Hep3B-Zellen (1 × 106) wurden zu 150-mm-Zellkulturplatten in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gegeben, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthielt. Während der letzten 24 Stunden der Kultur wurde das Medium mit TGFβ1 (5 ng/ml) ergänzt. Oligonukleotide zur Amplifikation der ABHD10- und GAPDH-Promotorregionen wurden von Shanghai Sangon Biotech (China) entworfen und synthetisiert. Alle ChIP-PCR-Schritte wurden mit einem EZ-ChIP-Kit (Millipore)17 durchgeführt, wobei der Immunpräzipitationsschritt über Nacht mit Anti-ELK3 (5 μg, #NBP1-83960, Novus) oder Kontrollkaninchen-IgG (5 μg, #NBP2-50261) durchgeführt wurde , Novus).

RIPA-Puffer (0,1 % SDS, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 1 % Triton 1 mM Na3VO4, 2 mM β-Glycerophosphat) wurde zur Lyse von Zellen und Gewebeproben verwendet. Lysate wurden einer Klickreaktion unter Verwendung von Biotinazid unterzogen, wie zuvor in Lit. beschrieben. 55. Kurz gesagt, die Klick-Reaktion wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln unter sanfter Rotation unter Verwendung von 100 μl Lysepuffer, enthaltend 50 μg Lysatprotein, 1 mM CuSO4, 1 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP), durchgeführt. 100 μM Biotinazid und 100 μM Tris((1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl-l)amin (TBTA). Die Reaktionen wurden mit 20 μl 6×SDS-Probenladepuffer (50 mM Tris-HCl [pH 6,8], 30 mM EDTA, 48 % Glycerin, 9 % MeSH, 6 % SDS und 0,03 % Bromphenolblau) gestoppt. Bei den mit Hydroxylamin (HA) behandelten Proben wurde vor der Zugabe des 6-fachen SDS-Probenladepuffers 30 Minuten lang HA (2,5 % v/v) zur Reaktionsmischung gegeben. Auf S-Palmitoylierung kann durch die Anreicherung eines Zielproteins in den HA-behandelten Proben im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollproben geschlossen werden56.

Die mit Biotin markierten Proteine ​​wurden 3 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Rotation mit Streptavidin-Agarose-Kügelchen (Life Technologies) gemischt. Die mit markierten Proteinen verbundenen Streptavidin-Agarose-Kügelchen wurden dann dreimal mit Immunpräzipitationspuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA und 0,5 % NP40) gewaschen. Die gebundenen Proteine ​​wurden mit Elutionspuffer (95 % Formamid mit 10 mM EDTA (pH 8,2)) 10 Minuten lang bei 95 °C eluiert. Die Proben wurden wie unten beschrieben einem Western Blot unterzogen.

Zellen und Gewebeproben wurden wie oben beschrieben lysiert. Lebergewebeproben wurden vor der Ultraschallbehandlung (50-W-Sonde, 20 % Amplitude; fünf Zyklen von 20 s/Zyklus) im Verhältnis 1:20 (mg:μl) verdünnt. Western Blot wurde durchgeführt, indem 40 µg Protein pro Probe in Laemli-Puffer (AlfaAesar) verdünnt, diese Proben 3 Minuten lang auf 95 °C erhitzt und vor der Übertragung auf eine Nitrozellulosemembran mittels SDS-PAGE (Bio-Rad) getrennt wurden ( Porengröße: 0,2 µm, Bio-Rad). Anschließend wurden die Blots 1 Stunde lang mit 5 % fettfreier Milch in TBS-T blockiert, gefolgt von einer Inkubation über Nacht mit geeigneten Primärantikörpern (Supp. Table S3). Als Beladungskontrolle wurde β-Actin verwendet. Die Blots wurden dann dreimal mit TBS-T gewaschen und 1 Stunde lang mit artgerechten HRP-konjugierten Sekundärantikörpern sondiert (Supp. Table S3). Schließlich wurde den Membranen ein Chemilumineszenzsubstrat (ECL, Bio-Rad) zugesetzt und die Blots wurden mit ChemiDoc (Bio-Rad) aufgelöst. Bandenquantifizierung, quantifiziert mit der ImageJ-Software.

Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism 7 durchgeführt. Balken- und Liniendiagramme zeigen Mittelwerte ± Standardabweichungen (SDs) an. Box-and-Whisker-Diagramme zeigen Mediane, Interquartilbereiche (IQRs, 25.–75. Perzentil) und einzelne Werte an. Alle Gen- und Proteinexpressionsanalysen wurden auf die Median- oder Mittelwerte der Kontrollproben normalisiert. Vergleiche zwischen Gruppen wurden mithilfe des ungepaarten zweiseitigen Student-T-Tests, des exakten Fisher-Tests, des zweiseitigen Mann-Whitney-U-Tests, einer einfachen ANOVA, einer ANOVA mit wiederholten Messungen oder einer zweiseitigen ANOVA bewertet, wie in den Abbildungslegenden angegeben. Es wurde keine statistische Methodik verwendet, um die experimentellen Stichprobengrößen vorab zu bestimmen. Alle In-vivo-Experimente wurden mit n = 6 Mäusen pro Kohorte durchgeführt, während alle In-vitro-Experimente mit n = 9 unabhängigen biologischen Replikaten pro Gruppe durchgeführt wurden. Die Experimente wurden nicht randomisiert, mit Ausnahme der rAAV-Studien, bei denen Mäuse blockweise randomisiert wurden und rAAV.Ctrl oder rAAV.Abhd10 erhielten. Es wurden keine Daten aus den gemeldeten Ergebnissen ausgeschlossen; Alle biologischen Replikate wurden für statistische Analysen verwendet. Während der Datenanalyse waren die Forscher hinsichtlich der Gruppenzuordnung blind.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. Numerische Quelldaten für alle Grafiken und Diagramme wurden in der Ergänzungsdatendatei bereitgestellt. Unbeschnittene Western-Blot-Bilder wurden in Supp bereitgestellt. Abb. S12.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Zuschuss-Nr. 82060118), dem Forschungsprogramm für Wissenschaft und Technologie an den Universitäten der Autonomen Region Innere Mongolei (Zuschuss-Nr. NJZY20203) und dem Programm für junge Talente der Chifeng-Universität unterstützt (Förderungsnr. CFXYYT2202).

Abteilung für Molekularbiologie, College of Basic Medical Science, Chifeng University, Chifeng, 024000, China

Tian-Zhu Li, Chun-Ying Bai, Tie-Wei Shi und Jing Zhou

Abteilung für Gewebe und Embryologie, College of Basic Medical Science, Chifeng University, Chifeng, 024000, China

Bao Wu

Abteilung für Pharmazie, College of Basic Medical Science, Chifeng University, Chifeng, 024000, China

Cong-Ying Zhang

Abteilung für Pathogene Biologie, College of Basic Medical Science, Chifeng University, Chifeng, 024000, China

Wen-Tao Wang

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Konzeption und Gestaltung der Studie: T.-ZL und C.-YB Durchführung der experimentellen Verfahren: T.-ZL, C.-YB, BW, C.-YZ und W.-TW Analyse der Daten: SIRIGULENG, T. -WS und JZ Verfasser des Manuskripts: T.-ZL

Korrespondenz mit Tian-Zhu Li.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Christopher Hine und Joao Valente. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 26. Juni 2022

Angenommen: 19. Juni 2023

Veröffentlicht: 03. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05055-y

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