Ableitung des nutzbaren Designraums von RP

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 4334 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Für die gleichzeitige Bestimmung von Metforminhydrochlorid (MET), Pioglitazon (PIO) und Glimepirid (GLM) in ihren kombinierten Dosierungsformen und versetztem menschlichem Plasma wurde eine Umkehrphasen-RP-HPLC-Methode entwickelt. Zum Screening von CMPs wurden Grundsätze des Qualitätsrisikomanagements zur Bestimmung der kritischen Methodenparameter (CMPs) und ein fraktioniertes faktorielles Design erstellt. Anschließend wurde das Box-Behnken-Design angewendet. Das analytische Quality by Design (AQbD)-Paradigma wurde verwendet, um den methodenoperablen Designbereich (MODR) für die entwickelte Methode festzulegen, der vom Verständnis des Qualitätszielproduktprofils (QTPP), des analytischen Zielprofils (ATP) und der Risikobewertung für verschiedene Faktoren abhängt die sich auf die Methodenleistung auswirken, um eine genaue, präzise, ​​kostengünstige und umweltfreundliche Methode zu entwickeln. Die Trennung wurde unter Verwendung einer mobilen Phase durchgeführt, die aus Methanol bestand: 0,05 M Kaliumdihydrogenphosphatpuffer, pH 3,7, mit 0,05 % TEA (78:22, Vol./Vol.). Die Flussrate betrug 1,2 ml/min. Der DAD-Detektor wurde auf 227 nm eingestellt. Als interner Standard wurde Linagliptin (LIN) verwendet. Die vorgeschlagene Methode wurde gemäß dem International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) validiert. Die mit der entwickelten Methode erhaltenen Testergebnisse wurden statistisch mit denen der beschriebenen HPLC-Methode verglichen und es wurde eine zufriedenstellende Übereinstimmung festgestellt.

Diabetes ist eines der sich schnell ausbreitenden Gesundheitsprobleme in Ägypten mit erheblichen Auswirkungen auf Morbidität, Mortalität und Gesundheitsprobleme1. Die International Diabetes Federation (IDF) bezeichnet Ägypten als das Land mit der neunthöchsten Zahl an Diabetikern der Welt.

Metformin (MET, Abb. S1a) ist ein Biguanid, ein orales Antidiabetikum2 zur Behandlung von Typ-II-Diabetes3. Es reduziert die Glukoseproduktion der Leber und minimiert den Triglycerid- und Cholesterinspiegel3.

Pioglitazon (PIO, Abb. S1b) ist ein Thiazolidindion-Typ, auch „Glitazone“ genannt4. Thiazolidindione sind Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPAR-gamma)-Agonisten, die zur Behandlung von Diabetes Typ II eingesetzt werden. Pioglitazon ist bekannt dafür, den Blutzuckerspiegel aktiv zu kontrollieren, indem es die Insulinresistenz reduziert4. Es wird entweder einzeln oder in einer Mischung von Antidiabetika eingesetzt. Die Zugabe von PIO zu MET und/oder Insulinsekretagoga als Teil einer oralen Dreifachtherapie bei Patienten mit Diabetes (Typ II) oder bei Versagen binärer Medikamente ist für das Erreichen glykämischer Ziele, die Verbesserung der β-Zellfunktion und die Minimierung der Risikofaktoren bei Arteriosklerose von wesentlicher Bedeutung5 . PIO verbessert auch das glykierte Hämoglobin A1c (HbA1c) und den Nüchternplasmaglukosespiegel (FPG)5.

Glimepirid (GLM) (Abb. S1c) ist ein langwirksames orales Antidiabetikum, das zur Senkung des Blutzuckerspiegels eingesetzt wird6. GLM wird ausschließlich zur Behandlung von Diabetes Typ II eingesetzt. GLM kann zusammen mit Insulin oder anderen Arzneimitteln verwendet werden, um eine bessere Kontrolle des Blutzuckerspiegels zu erreichen6.

Für die Schätzung von MET7,8,9,10,11, PIO12,13,14,15,16 oder GLM17,18,19,20,21 allein und in Kombinationen (MET und PIO)22 wurden verschiedene analytische Ansätze berichtet. 23,24,25,26,27, (MET und GLM)28,29,30 und (PIO und GLM)31,32.

Tribet-1- und Tribet-2-Tabletten bestehen aus (500 mg MET, 15 mg PIO und 1 mg GLM) bzw. (500 mg MET, 15 mg PIO und 2 mg GLM)33. Diese Wirkstoffe sind wirksam für Patienten, die mehrere Wirkstoffe benötigen, um ihren Blutzuckerspiegel zu senken.

Chromatografische Methoden sind für ihre Überlegenheit bei der Trennung und Quantifizierung von Komponenten in komplexen Gemischen bekannt34. Getrennte chromatographische Methoden haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie die Empfindlichkeit und Selektivität der Methode verbessern, indem sie fortschrittliche spektroskopische Techniken zur Erkennung und Quantifizierung von Komponenten verwenden35,36,37. Für die gleichzeitige Analyse dieser dreifachen antidiabetischen Mischung wurden mehrere Analysemethoden beschrieben, darunter RP-HPLC-Methoden33,38,39,40,41, LC-MS-MS30 und HPTLC42.

Die beschriebenen RP-HPLC-Methoden33,38,39,40,41 hatten einige Nachteile, darunter: fragwürdige Methoden und/oder Mangel an zufriedenstellenden Validierungsparametern. Bei der beschriebenen Methode33 fehlten einige Validierungsparameter (LOD und LOQ) sowie Systemeignungsparameter (Auflösung) sowie ein sehr niedriger MET (NTP)33. Die gemeldeten Methoden38,40 hatten eine Hochgeschwindigkeitstrennung und eine kurze Laufzeit, die nicht mit den gemeldeten Auflösungswerten kompatibel waren38,40. Außerdem identifizierte die berichtete Methode37 nicht die vollständigen Details der Regressionsanalyse38. Die gemeldeten Methoden33,38,39 konzentrierten sich weder auf die Bewertung der Umweltverträglichkeit noch auf die Anwendbarkeit biologischer Proben. Bei der beschriebenen Methode39 erschien der MET-Peak vor dem Plasmapeak und die Retentionszeit des Plasmapeaks in aufgestockten Proben stimmte nicht mit der des leeren Plasmachromatogramms überein. Keine der gemeldeten Methoden33,38,39,40,41 verwendete IS in ihren Berechnungen.

AQbD ist eine auf Risikobewertung basierende und systematische Methode, die darauf abzielt, die Variabilitätsquellen zu finden und zu reduzieren, die zu einer schlechten Robustheit der Analysemethode führen können, und um zu bestätigen, dass die Methode ihre beabsichtigten Leistungsanforderungen erfüllt43. In den analytischen Quality-by-Design-Modellen (AQbD) basiert der „Designraum“ auf dem beabsichtigten Zweck der entwickelten Analysemethode, der ihre Leistung mit zulässigen Änderungen ermöglicht.

Der aktuelle AQbD-Ansatz basiert auf der Untersuchung des Qualitätszielproduktprofils (QTPP), des analytischen Zielprofils (ATP) und eines Risikobewertungstools für Faktoren oder kritische Methodenparameter (CMPs), die sich auf die Methodenleistung auswirken43. Ziel des (ATP) war es, eine robuste, empfindliche und umweltfreundliche RP-HPLC-Technik zu etablieren und zu validieren. Die Bestimmung der (ATP), kritischen Qualitätsattribute (CQAs) und kritischen Methodenparameter (CMPs) ist einer der wesentlichen Schritte bei der Methodenentwicklung. Ishikawa-Diagramme als Risikobewertungstools können dabei helfen, die Auswirkungen verschiedener CMPs auf die CQAs zu ermitteln.

Design of Experiments (DOE) verwendet multivariate statistische Techniken mit Vorteilen, wie z. B. der Verringerung der Gesamtzahl der erforderlichen Versuchsläufe. DOE ermöglicht die Erstellung mathematischer Modelle zur Bewertung der statistischen Signifikanz verschiedener Effekte unter vielen trivialen Parametern, um die wenigen entscheidenden zu bestimmen ones44.

Dieses Papier stellt die erste HPLC-Methode zur gleichzeitigen Bestimmung der genannten Arzneimittel dar, die auf den Vorzügen der AQbD-Technik während der Entwicklung und Optimierung basiert. Somit übertrifft die vorgeschlagene Methode zuvor veröffentlichte Methoden zur Bestimmung der untersuchten Dreifachmischung, insbesondere für die GLM-Konzentration in einem schwierigen Dosierungsformverhältnis. (1:15:500) (GLM: PIO: MET). Das Papier konzentrierte sich auf die Spezifizierung des Bereichs des experimentellen Raums, in dem sich Toleranzintervallkriterien für die untersuchten chromatographischen Parameter überschneiden, um den method operable design region (MODR) zu erhalten. Die Technik ermöglicht eine Erweiterung der Methodenanwendungen in biologischen Proben durch Zugabe des internen Standards zu den analysierten Verbindungen.

MET (99,00 %), LIN (99,7 %), PIO (99,5 %) und GLM (99,7 %). Zu den Hilfsstoffen gehörten mikrokristalline Hypromellose, Cellulose, Magnesiumstearat, Hydroxypropylmethylcellulose, vorverkleisterte Stärke, Laktosemonohydrat, Croscarmellose-Natrium, vorverkleisterte Stärke und kolloidales Siliciumdioxid. Alle im Experiment verwendeten Materialien waren Geschenke von Sigma für die Pharmaindustrie (Industriegebiet Moubarak, Quesna-Menoufia-Ägypten). Nach Abschluss der erforderlichen Prozesse wurden freundlicherweise menschliche Plasmaproben vom Blutbankzentrum des Universitätsklinikums Tanta zur Verfügung gestellt. Alle Methoden wurden unter Einhaltung relevanter Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Die auf dem ägyptischen Markt erhältlichen Dosierungsformen sind Amaryl M 2/500 (2 mg Glimepirid und 500 mg Metformin) mit der Chargennummer: 2/2024 von SANOFI AVENTIS-HANDOK Pharmaceuticals, Bioglita Plus (15/500) mit der Chargennummer: 200061, hergestellt von Al Andalous für Pharmaceutical Ind. (15 mg Pioglitazon und 500 mg Metformin) und Piompride 30/4, Chargennummer: 191294, AVERROES PHARMA-Ägypten (30 mg Pioglitazon und 4 mg Glimepirid).

Methanol in HPLC-Qualität wurde von (Fisher, UK) bezogen. Kaliumdihydrogenphosphat, erhalten von (Inter. Trade Co., Japan). Orthophosphorsäure in analytischer Qualität wurde von (Sigma-Aldrich, Deutschland) bezogen. TEA in HPLC-Qualität wurde von (Oxford Laboratory, UK) gekauft.

Dionex UltiMate 3000 RS-System (Thermo Scientific™, Dionex™, Sunnyvale, CA, USA) mit RS-Autosampler-Injektor, RS-Diodenarray-Detektor, quaternärer RS-Pumpe und thermostatisiertem RS-Säulenfach. Zur Datenerfassung wird die Software ChromeleonR 7.1 verwendet. Vortex (A & E, UK) und Hettich Centrifuge (Tuttlingen, Deutschland). Ein HANNA pH-Meter (USA). Design-Expert-Software Version 11 für die Versuchsplanung (DOE).

Die aus dem Screening-Design qualifizierten CMPs wurden auf verschiedenen Ebenen unter Verwendung des Box-Behnken-Optimierungsdesigns getestet. Die Werte des CAA wurden verwendet, um optimale chromatographische Bedingungen durch eine mathematische Technik unter Verwendung des Derringer-Wünschbarkeitsalgorithmus innerhalb des vorgegebenen MODR zu bewerten, wobei die Werte verwendet wurden, die die Toleranzintervallkriterien für die untersuchten chromatographischen Parameter am besten erfüllen. Die Trennung wurde unter Verwendung von Methanol:0,05 M Kaliumdihydrogenphosphatpuffer mit 0,05 % Triethylamin (78:22, Vol./Vol.) als mobile Phase durchgeführt. Der pH-Wert des Puffers wurde unter Verwendung von Orthophosphorsäure auf pH 3,79 eingestellt. Detektion bei 227 nm mittels DAD. Es wurde eine Flussrate von 1,2 ml/min verwendet.

Stammlösungen (1000 µg/ml) wurden für die drei Arzneimittel (MET, PIO, GLM) und für den internen Standard (LIN) durch Abwiegen von jeweils 100 mg hergestellt, dann in vier separate 100-ml-Messkolben überführt und anschließend mit Methanol verdünnt bei 4 °C im Kühlschrank gelagert. Anschließend wurden geeignete Verdünnungen jeder Stammlösung hergestellt, um Arbeitsstandardlösungen herzustellen und mit der mobilen Phase 50 µg/ml MET, LIN und PIO und 40 µg/ml GLM zu erhalten.

Unterschiedliche Volumina der zuvor hergestellten Arbeitsstandardlösungen wurden in separate 10-ml-Messkolben mit einem konstanten Volumen an LIN (IS) (20 µL) überführt und die Volumina mit der mobilen Phase verdünnt. Es wurden Verdünnungen vorgenommen, um Lösungen zu erhalten, die den dynamischen Arbeitsbereich von 0,05–30,00 µg/ml PIO, 0,05–500,00 µg/ml MET und 0,04–20,00 µg/ml GLM abdecken. Von jeder Lösung wurden 10 µL injiziert und die Trennung erfolgte unter Verwendung der zuvor genannten Trennbedingungen. Die Kalibrierungskurven wurden durch Auftragen des durchschnittlichen Peakflächenverhältnisses (0,1 µg/ml LIN) gegen die Konzentration erstellt und die Regressionsgleichungen berechnet.

Verschiedene Konzentrationen wurden in dotiertem Humanplasma hergestellt, indem Arbeitsstandardlösungen (50 µg/ml) des internen Standards (LIN) und der betreffenden Antidiabetika verwendet wurden. Die Erstellung von Kalibrierungskurven erfolgte durch Auftragen des durchschnittlichen Peakflächenverhältnisses (0,10 µg/ml LIN) gegen die entsprechenden Arzneimittelkonzentrationen in dotierten menschlichen Plasmaproben, die den dynamischen Arbeitsbereich von 0,04–2,00 µg/ml GLM und 0,05–2,00 µg abdecken /ml MET und PIO.

Vor der Analyse ließ man die gefrorene Humanplasmaprobe etwa eine Stunde lang auftauen und auf Raumtemperatur äquilibrieren. Unter Verwendung eines Multipulsvortex bei 2000 U/min wurde das aufgetaute Plasma 30 s lang gevortext, um die gute und homogene Durchmischung des Probeninhalts zu bestätigen. In einem Zentrifugenröhrchen ein Aliquot von 100 µL Blindplasma, ein anderes Aliquot aus einer 50 µg/ml Arbeitsstandardlösung jedes Arzneimittels. Die erhaltenen Lösungen wurden durch Verwendung von bis zu 5 ml Methanol vervollständigt und zweimal bei 2000 U/min verwirbelt, um 30 Sekunden lang zu mischen und so die Proteinausfällung sicherzustellen. Die erhaltenen Plasmaprobenlösungen wurden 30 Minuten lang bei 4000 U/min zentrifugiert. Von jedem Überstand wurde 1 ml in einen 5-ml-Messkolben gegeben und die Lösungen wurden mithilfe der mobilen Phase auf 5 ml verdünnt. Anschließend wurde ein Celluloseacetat-Spritzenfilter (0,45 μm) zum Filtrieren aller vorbereiteten Lösungen verwendet. Von jeder Lösung wurde unter den zuvor angegebenen Trennbedingungen ein Aliquot von 10 µL injiziert.

Tribet 2 XR-Tabletten enthalten (2 mg GLM, 15 mg PIO und 500 mg MET) pro Tablette33 und sind auf dem ägyptischen Markt nicht erhältlich. Simulierte synthetische Tabletten wurden hergestellt und zur Analyse im Hinblick auf die Herstellung einer im Labor hergestellten Tablette45 verwendet. Die Formel pro fünf Tabletten wurde durch Abwiegen von 2,5 g MET, 75 mg PIO und 10 mg GLM mit den folgenden Hilfsstoffen entwickelt: 614,4 mg mikrokristalline Cellulose, 35 mg Magnesiumstearat, 75 mg Hypromellose, 75 mg Hydroxypropylmethylcellulose, 568 mg vorverkleisterte Stärke, 740 mg Lactose-Monohydrat, 45 mg Croscarmellose-Natrium und 10 mg kolloidales Siliciumdioxid. In einen 100-ml-Messkolben wurde das Gewicht einer Tablette überführt und mit 70 ml Methanol gelöst. Die erhaltene Lösung wurde 20 Minuten lang beschallt, abgekühlt und unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels bis zur Marke vervollständigt. Die erhaltene Lösung wurde filtriert und die Rückstände gewaschen. Es wurden Reihenverdünnungen durchgeführt, um unterschiedliche Konzentrationen der drei Arzneimittel herzustellen.

Zehn Tabletten Amaryl M 2/500, Bioglita Plus oder Piompride-Tabletten wurden in drei separaten Mörsern gewogen, gemahlen und pulverisiert. In separate 100-ml-Messkolben wurden Pulvergewichte entsprechend (500 mg MET und 2 mg GLM), (15 mg PIO und 500 mg MET) und (15 mg PIO und 2 mg GLM) überführt und unter Verwendung von 75 ml Methanol gelöst , jeweils. Die Lösungen wurden 15 Minuten lang beschallt, abgekühlt und unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels auf das Volumen aufgefüllt. Die Lösungen wurden filtriert, dann wurden die Rückstände gewaschen. Es wurden Verdünnungen vorgenommen, um über die drei Dosierungsformen unterschiedliche Konzentrationen der beiden Arzneimittel zu erreichen.

Der erste Schritt bei der AQbD-Methode bestand darin, den (QTPP) des pharmazeutischen Endprodukts zu bestimmen, und dann wurde der (ATP) basierend auf dem zuvor bestimmten (QTPP) identifiziert. Anschließend hängt die Bestimmung der (CQAs) von ersten Versuchen und der Literaturrecherche ab.

Es wurde eine Risikoanalyse durchgeführt, um die CQAs zu skizzieren und zu bestimmen, die sich auf die Effizienz und Leistung der Methode auswirken könnten. Das Ishikawa-Diagramm als Instrument zur Risikobewertung kann dabei helfen, die Auswirkungen verschiedener kritischer Methodenparameter von CMPs auf die CQAs zu definieren46.

Ziel dieser Arbeit ist es, die drei Antidiabetika mit optimaler Auflösung und Selektivität und minimaler Laufzeit ohne Beeinträchtigung durch endogene Matrixverbindungen zu trennen und zu analysieren.

Zur Bestimmung der signifikanten Parameter (CMPs), die die Leistung der RP-HPLC-Methode beeinflussen, wurde ein Fischgräten- oder Ishikawa-Diagramm erstellt. Das Ishikawa-Diagramm zeigt verschiedene Faktoren, die berücksichtigt werden könnten (Säulentemperatur, Säulenlänge, Flussrate, Art des organischen Lösungsmittels, Prozentsatz des organischen Lösungsmittels, Injektionsvolumen, Detektor, Puffertyp, Pufferkonzentration und Puffer-pH). Anschließend wurden Vorversuche durchgeführt, um die äußerst kritischen Faktoren auszuwählen, die in das Screening-Design einbezogen werden sollten (nächster Schritt).

Es wurden fünf Faktoren qualifiziert, die die Methodenleistung am stärksten beeinflussen (Durchflussrate, Prozentsatz an Methanol (%MeOH), Säulentemperatur, Puffer-pH und Pufferkonzentration).

Das Screening ist eine entscheidende Phase in der AQbD, um die kritischen oder signifikanten Faktoren zu charakterisieren, bevor mit dem Optimierungsdesign begonnen wird. Das vollständige faktorielle Design für fünf Faktoren mit zwei Ebenen für die Screening-Phase führt zu 25 = 32 Experimenten (riesige Zahl). Ein fraktioniertes faktorielles Design (FFD) mit einer Auflösung V (25–1 = 16 Experimente) wurde durchgeführt, um die Anzahl der Versuche während der Optimierung zu verringern und eine Analysemethode zur Charakterisierung des Einflusses verschiedener CMP auf die ausgewählten CQAs zu entwickeln. Die Regressionskoeffizienten der untersuchten CMPs wurden mithilfe eines mathematischen Modells bestimmt, das aus dem Design gewonnen wurde und aus Haupt- und möglichen Wechselwirkungseffekten (Gleichung 1) für jeden der folgenden Punkte besteht:

Fünf Antworten oder (CQA): Auflösung 1 zwischen MET und LIN (Rs-1), Kapazitätsfaktor 1 von MET (K′1), Auflösung 3 zwischen PIO und GLM (Rs-3), Kapazitätsfaktor 4 von GLM (K′4) und MET-Asymmetrie (assym-MET).

Dabei stellen β0, βi und βij die Koeffizienten für jeden Haupt- und Wechselwirkungseffekt dar, n ist die Anzahl der CMPs, X ist der untersuchte Faktor, Y ist die gemessene Reaktion und ε stellt die Modellresiduen dar.

Die unwesentlichen Faktoren würden bei der Optimierung übersehen und konstant gehalten. Die günstigsten CMP-Werte, die sich aus dem Screening-Design ergaben, wurden durch weitere Optimierung mithilfe der Response-Surface-Methode ermittelt. Die drei wichtigen CMPs (Puffer-pH, Durchflussrate und % MeOH) wurden von Box-Behnken Design mit drei Stufen optimiert, um die günstigsten Werte jedes Parameters zu ermitteln. Der Entwurf bestand aus insgesamt 17 Experimenten (5 Zentren + 12 Nicht-Zentrum), um die experimentellen Fehler zu berücksichtigen. Das Optimierungsverfahren stützte sich auf sechs CQAs mit den Namen: Auflösung 1 (Rs-1: MET und LIN), Kapazitätsfaktor 1 (K′1), Auflösung 3 (Rs-3: PIO und GLM) und Kapazitätsfaktor 4 ( K′4), Anzahl der theoretischen Böden von MET (NTP-MET) und GLM (NTP-GLM).

Die MODR wurde auf Basis der Regressionsmodelle und unter Verwendung derselben Software mit einer Schätzung der Ausfallwahrscheinlichkeit ermittelt. Alle in der ATP genannten Kriterien innerhalb der Designregion werden erfüllt.

Basierend auf dem CQAs-Toleranzintervall (TI) mit dem geeigneten Sigma (S) und dem akzeptablen Delta (d) wurden die designierten CQAs vorhergesagt und mit einem Anteil von 0,90 (einseitig) und einer Wahrscheinlichkeit (α) = 0,05 dargestellt. Der Bereich des experimentellen Raums, der die Toleranzintervallkriterien (TI) schneidet, wurde als MODR des etablierten HPLC-Ansatzes definiert. Die Modelle des Desringer-Wünschbarkeitsalgorithmus, die angewendet werden, um die optimalsten Niveaus jedes CMP vorzuschlagen, hängen von den eindeutigen Optimierungskriterien ab.

Die QTPP-Bestimmung basierte auf dem Verabreichungssystem, dem Verabreichungsweg, der Art der Darreichungsform und der Stabilität der untersuchten Arzneimittel sollten berücksichtigt werden47,48. ATP wurde abhängig vom ermittelten QTTP identifiziert, um eine effizientere RP-HPLC-Analysetechnik zu erhalten, mit der alle APIs innerhalb eines akzeptablen Bereichs (98–102) %, geeigneter Retentionszeiten, symmetrischer und scharfer Peaks und angemessener Spezifität identifiziert und bestimmt werden können. Die Auswahl der (CQAs) erfolgte auf der Grundlage vorläufiger Versuche und einer Durchsicht der Literatur.

Die Risikobewertung stützte sich auf das Fischgräten- oder Ishikawa-Diagramm Abb. S2, das unter Berücksichtigung früherer wissenschaftlicher Erkenntnisse und vorläufiger Versuche erstellt wurde. Vorläufige Studien wurden durchgeführt, indem verschiedene Flussraten, Säulen, wässrige Phase, Anteile der mobilen Phase und organische Modifikatoren ausprobiert wurden. Basierend auf den Ergebnissen vorläufiger Versuche gab es einige Probleme hinsichtlich der Peak-Asymmetrie von (MET) und der Auflösung zwischen (MET & LIN) und (PIO & GLM). Die Empfindlichkeit der Methode gegenüber GLM der niedrigsten Konzentration in der analysierten Dosierungsform musste berücksichtigt werden. Die Peakasymmetrie wird stark vom pH-Wert des Puffers, der Säulentemperatur, dem Typ und dem Prozentsatz des organischen Modifikators beeinflusst, während die Flussrate die Auflösung, Form und Fläche der Peaks beeinflussen kann.

Eine Liste der kritischsten Parameter, die in den Vorversuchen festgestellt wurden, wurde als Faktoren oder CMPs für das Screening-Design verwendet (A: % MeOH, B: Durchflussrate, C: Säulentemperatur, D: Puffer-pH und E: Pufferkonzentration). Die Screening-Phase basierte auf fünf CQAs: Rs-1, Rs-3, K′-1, K′-4 und Asym-MET.

Aufgrund der großen Variabilität der analysierten Triplett-Darreichungsformkomponenten und der binären Komponenten (500 mg MET, 15 mg PIO, 2 mg GLM) war ein Kompromiss bei der Auswahl der Detektionswellenlänge mithilfe des DAD-Detektors erforderlich. Die Wellenlänge 227 nm wurde dort ausgewählt, wo die GLM-Signalintensität am höchsten war. Im Gegensatz dazu war die MET-Signalintensität niedrig, um den gleichzeitigen Nachweis beider Medikamente (MET und GLM) bei diesem Verhältnis zu ermöglichen. LIN wurde als IS der Wahl ausgewählt; Für das Plasma wurde eine Konzentration von 0,1 µg/ml und für die Trennung und Analyse in reiner Form eine Konzentration von 5 µg/ml verwendet.

Die Verfahren, die befolgt wurden, um die CMPs zu bestimmen, die jede Antwort erheblich beeinflusst haben (CQA):

Untersuchung des Pareto-Diagramms, Halbnormalwahrscheinlichkeitsdiagramme und anschließend Auswahl der signifikanten Modellterme.

Überprüfung der Anpassungsstatistiken (R2 und angepasstes R2).

ANOVA-Interpretation mit Inspektion der Modellresiduen und Faktorsignifikanz.

Interpretation der Vorhersagegleichungskoeffizienten basierend auf Vorzeichen und Betrag.

Überprüfung der Integrität von ANOVA-Diagnosediagrammen.

Charakterisierung der signifikanten Faktorleistung basierend auf den entwickelten Modelldiagrammen.

Ein Halbnormalwahrscheinlichkeitsdiagramm ist ein grafisches Tool, das diese geordneten geschätzten Effekte verwendet, um zu beurteilen, welche Faktoren wesentlich und welche unwichtig sind. Es zeigt die absoluten Werte des standardisierten |effect| an vom Größten zum Kleinsten. Der geschätzte |Effekt| eines unbedeutenden Faktors wurde denen auf oder nahe der Nulllinie zugeordnet, während der geschätzte |Effekt| denen außerhalb der Linie ein wesentlicher Faktor zugeordnet wurde. Anschließend erfolgt die Bestätigung durch die Größe des F-Werts und des entsprechenden p-Werts aus den ANOVA-Ergebnissen sowie die Größe und das Vorzeichen der Vorhersagegleichungskoeffizienten. Das positive Vorzeichen jedes Parameterkoeffizienten zeigt an, dass eine Auswirkung des Parameters die Reaktion begünstigt, während ein negatives Vorzeichen auf eine umgekehrte Beziehung zwischen dem Parameter und der Reaktion hindeutet. Tabelle S1 stellt die experimentellen Ergebnisse der 16 fraktionierten faktoriellen Design-Screening-Experimente dar. Für jede Antwort berechnete ANOVA-Ergebnisse, wie z. B. der p-Wert zusammen mit den geschätzten Antwortkoeffizienten größer als 0,9, sind in Tabelle 1 dargestellt, und es wurde folgende Schlussfolgerung gezogen:

Auflösung-1 zwischen (MET & LIN) Peaks (Rs-1):

(Rs-1) wurde durch drei Faktoren (A, C und D) beeinflusst; MeOH % (A) hatte den wichtigsten und signifikantesten Effekt, während die Temperatur (C) den geringsten Effekt hatte. Erhöhte A und C verringerten sich (Rs-1). (Abb. 1a). Im Gegenteil, abnehmendes (D) verringerte (Rs-1).

Halbnormalwahrscheinlichkeitsdiagramme fraktioneller faktorieller Entwurf (FFD).

Auflösung-3 zwischen (PIO und GLM) Peaks (Rs-3):

(Rs-3) wurde stark durch den pH-Wert des Puffers (D), %MeOH (A) und die Säulentemperatur (C) beeinflusst, wobei sich alles negativ auswirkte. Eine Erhöhung des Puffer-pH-Werts auf pH 5 führte also zu einem starken Rückgang des Rs-3-Werts. Es gab eine Faktoreninteraktion zwischen Faktoren (A&D) (Abb. 1b).

Eine weitere Charakterisierung der CMPs, die sich auf jede CQA auswirken, erfolgte durch die Untersuchung von Interaktionsdiagrammen, die ein sehr hilfreiches Werkzeug zur Qualifizierung der wichtigen Parameter und zur Auswahl geeigneter konstanter Werte für die ausgeschlossenen Parameter sind. Durch die Untersuchung des Interaktionsdiagramms (A&D) (Abb. S3) konnte ein Rs-3-Wert von mehr als 2 durch einen Puffer-pH-Wert (3) mit einem MeOH-Gehalt von 78 % erreicht werden.

MET-Asymmetrie (Assym-MET):

Die MET-Asymmetrie wurde sowohl durch %MeOH (A) als auch durch den pH-Wert des Puffers (D) positiv beeinflusst. Eine Verringerung des MeOH-Prozentsatzes (A) oder des Puffer-pH-Werts (D) führte also zu einer Verringerung der MET-Asymmetrie.

Die MET-Asymmetrie war die einzige Reaktion, die durch die Pufferkonzentration (E) negativ beeinflusst wurde. Um den MET-Asymmetriewert zu verringern, sollte die Pufferkonzentration auf dem hohen Niveau von 0,05 M verwendet werden. Daher wurde beschlossen, die Pufferkonzentration (E) während des Verfahrensoptimierungsschritts konstant bei (0,05 M) zu halten (Abb . 1c).

Kapazitätsfaktor-1 (K′-1):

(K′-1) wurde stark und negativ durch die Flussrate (B) beeinflusst. (K′-1) wurde auch durch MeOH % (A) positiv beeinflusst, jedoch in sehr geringem Maße im Vergleich zum Effekt der Durchflussrate (B) (Abb. 1d).

Kapazitätsfaktor-4 (K′-4):

K′-4 wurde durch % MeOH (A), Puffer-pH (D), Flussrate (B) und Temperatur (C) in unterschiedlichem Ausmaß negativ beeinflusst (Abb. 1e).

Nach der Prüfung der Ergebnisse des Screening-Designs wurden die wenigen zu optimierenden wichtigen Faktoren (A: MeOH %), (B: Durchflussrate) und (D: Puffer-pH) aufgrund ihrer stärkeren Auswirkungen für den Optimierungsschritt qualifiziert. Andererseits wurden die Faktoren (E: Pufferkonzentration) und (C: Säulentemperatur) konstant bei 0,05 M bzw. 25 °C gehalten. Eine niedrige Temperatureinstellung ermöglicht ein umweltfreundlicheres Trennverfahren und eine hohe Pufferkonzentration ist zur Kontrolle der MET-Peak-Asymmetrie unerlässlich. Der Bedarf an einer Optimierungsstrategie entstand aufgrund der Anforderung der variablen Faktoreinstellung, jede gemessene Reaktion einzeln zu verbessern, was Nichtlinearität impliziert, die besser durch die Verwendung von dreistufigen Antwortoberflächenoptimierungsdesigns beschrieben werden kann.

Der Zweck des AQbD-Ansatzes besteht darin, die (MODR) zu definieren und zu skizzieren, bei der es sich um eine mehrdimensionale Kombination und Interaktion von Eingabevariablen und Prozessfaktoren handelt, die zur Sicherstellung der Methodenqualität festgelegt wurden47. Mit anderen Worten: Es ist die Region der (CMPs), die die (CQAs) erfüllt. Mithilfe der DoE-Strategie wurde der anfängliche Wissensraum erkundet und ein MODR ermittelt, bei dem die im ATP genannten Kriterien bei einem bestimmten Risikoniveau erfüllt sind47.

Zur Bewertung der Einflüsse der drei qualifizierten CMPs (%MeOH, Durchflussrate und Puffer-pH) auf die ausgewählten CQAs wurde ein Box-Behnken-Design gewählt (Tabelle S2). In der Screening-Phase stellten wir in Lauf Nr. 9 (Tabelle S1 und Abb. S4) fest, dass es bei Verwendung der oberen Werte der fünf Faktoren zu einer starken Überlappung der letzten beiden Peaks kam. Das Box-Behnken-Design mit 17 Läufen (Tabelle S2) war besser geeignet, da es die gleichzeitige Kombination der oberen Ebenen aller Faktoren vermeidet und unserem Optimierungszweck entsprach.

Alle entwickelten Modelle waren quadratisch und die Variablen verhielten sich nichtlinear; Dies kann durch Terme höherer Ordnung (x2) angezeigt werden. Außerdem zeigten die Modelle hohe angepasste R2- und R2-Werte von mehr als 0,9, wie in (Tabelle S2) gezeigt, und einen unbedeutenden Mangel an Anpassung im Vergleich zu reinen Fehlerwerten, wobei alle auf eine gute Modellanpassung hinwiesen. Durch die Inspektion der erhaltenen Modellkoeffizienten (Tabelle 2) und 3D-Antwortoberflächen (Abb. 2a–f).

(Rs-1) zwischen (MET- und LIN)-Peaks: Abb. 2a zeigt eine Abnahme des (Rs-1)-Werts, die bei sinkendem % MeO beobachtet wird. (Rs-1)-Werte zwischen (2,2–3) wurden mit einem MeOH-Gehalt von mindestens 74 % und minimalem Einfluss des pH-Werts erreicht.

(Rs-3) zwischen (PIO- und GLM)-Peaks: Abb. 2b zeigt eine Abnahme der (Rs-3)-Werte bei steigendem pH-Wert und % MeOH. (Rs-3)-Werte zwischen (2,2–3,5) wurden mit %MeOH zwischen (74–77) % und einem pH-Wert zwischen (3–4) erreicht.

Kapazitätsfaktor-1 (K′-1): Abb. 2c zeigt, dass niedrigere (K′-1)-Werte durch Variationen von % MeOH und pH-Wert nicht erhalten wurden. Der (K′-1)-Wert wurde jedoch erheblich durch die in der Analyse verwendete Durchflussrate beeinflusst.

Kapazitätsfaktor 4 (K′-4): Abb. 2d zeigt eine Abnahme der (K′-4)-Werte bei steigendem %MeOH und in geringem Maße bei höheren pH-Werten. Minimale (K′-4)-Werte wurden mit einem MeOH-Gehalt von etwa 78 % erzielt, mit geringfügigem Effekt bei einem pH-Wert zwischen 3 und 5.

NTPs (MET) und (GLM): Abb. 2e,f zeigt, dass höhere NTPs von MET und GLM bei Verwendung von pH-Werten näher an 3 mit minimalem Effekt von % MeOH erreicht wurden.

Reaktionsflächen Box-Behnken-Design (BBD) für Faktorinteraktionen.

Die Erhöhung des GLM (NTP) und die Auswahl der geeigneten Detektionswellenlänge waren erfolgreiche Maßnahmen, die zu einer höheren Empfindlichkeit der Methode gegenüber GLM mit einem symmetrischeren und schärferen GLM-Peak führten. Der pH-Wert des Puffers hat einen quadratischen Effekt auf die NTPs von MET und GLM, und dieser Effekt kann mit anderen One-Factor-at-the-Time-Methoden (OFAT) nicht bestimmt werden. Aus den Entwurfsergebnissen wurde bei (3,7) der beste Puffer-pH-Wert ausgewählt, der die NTPs maximiert und angemessene Rs-Werte und Kapazitätsfaktoren liefert. Dieser pH-Wert führte zu einer Veränderung der Ionisierung beider Medikamente und maximierte die NTPs basierend auf den pKa-Werten von MET und GLM, die 11,5 bzw. 6,2 betragen.

Um die Ergebnisse des Optimierungsprozesses zusammenzufassen, war der % MeOH (A) der wichtigste Faktor, da er fast alle Antworten beeinflusste; In den meisten Fällen musste der MeOH-Prozentsatz erhöht werden. Die Durchflussrate (B) beeinflusst stark die Kapazitätsfaktoren (MET-K′-1) und (GLM-K′-4). Die Verwendung einer Flussrate von (1,2 ml/min) führte zum minimalen K′ für MET und GLM. Der Puffer-pH (C) hatte einen starken Einfluss auf die NTPs (MET und GLM) und das Rs-3 zwischen PIO und GLM.

Optimierungskriterien würden dabei helfen, die optimalen Werte verschiedener CMPs auszuwählen. Um die verschiedenen CQAs für eine optimale Methodeneffizienz und Leistung bei der Analyse der drei Arzneimittel zu optimieren, wurden die folgenden Kriterien dargestellt:

Minimierung von Rs-1 und R-3 im Bereich (2,2–3) bzw. (2,2–3,5).

Zur Minimierung von K′-1 und K′-4 für eine schnelle Elution und minimale Laufzeit.

Um die NTPs für MET und GLM zu maximieren.

Erwünschtheitsdiagramme Abb. S5a–c zeigt, dass zur Erreichung der maximalen Erwünschtheit der MeOH-Prozentsatz bei (76–78) % liegen sollte, der pH-Wert zwischen (3,5–4) liegen sollte und die Durchflussrate maximal sein sollte (1,2 ml/min).

Der Designbereich wurde durch die Anwendung von Einschränkungen (max. und min.) generiert, die erreicht wurden (Rs-1) unter 3,6, (Rs-3) unter 4,5, (K′-1) unter 1,98, (K′-4) unter 5,5, NTP MET unter 3000 und NTP GLM unter 5500 mit einem Ergebnisanteil, der den (TI) von 0,9 (einseitig) erreicht, wie in Tabelle S2 gezeigt.

Die in Abb. S5d–f dargestellten methodendurchführbaren Entwurfsbereiche (Überlagerungsdiagramme) zeigten, dass die optimalen und besten Bedingungen mit einem höheren MeOH-Verhältnis (76–78) erreicht werden konnten, der pH-Wert sollte zwischen (3,6–5) und die Durchflussrate liegen zwischen (1,05–1,2) ml/min liegen.

Unter Verwendung des Desirability-Algorithmus von Derringer ergaben sich für die ausgewählten Kriterien 30 Lösungen; Als optimale chromatographische Parameter wurden %MeOH(A) (78 %) (siehe Abb. 3a), Flussrate (B) (1,2 ml/min) (siehe Abb. 3b) und Puffer-pH (3,73) (siehe Abb. 3b) vorgeschlagen Abb. 3c mit erwarteten Attributwerten von Rs-1 (2.22) wie in Abb. 3d, Rs-3 (3.14) wie in Abb. 3e, K′-1 (1.48) wie in Abb. 3f, K′ -4 (3,78) wie in Abb. 3g dargestellt, NTP (MET) (2518) wie in Abb. 3h dargestellt und NTP (GLM):(4389) wie in Abb. 3i dargestellt mit einem Erwünschtheitswert von (0,552). Die Diagramme der Erwünschtheit sind in Abb. S5d–f dargestellt.

Lösungsrampen für optimale Bedingungen (a–i).

Diese vorgeschlagenen optimalen chromatographischen Bedingungen wurden dreimal verifiziert und getestet, und die Mittelwerte der beobachteten Werte waren Rs-1 (2,28), Rs-3 (3,42), K′-1 (1,49), K′-4 (4,08), NTP (MET) (2568) und NTP (GLM): (4520). Die vorhergesagten Werte wurden mit den beobachteten Werten verglichen, um die Vorhersagbarkeit des Modells zu demonstrieren. Alle Ergebnisse waren zufriedenstellend, mit geringen Vorhersagefehlern.

Schließlich war 78:22 % MeOH: 0,05 M Phosphatpuffer mit (0,05 v/v % Triethylamin) pH (3,73) die optimale mobile Phase. 25 °C Säulentemperatur, 1,2 ml/min Flussrate und der PDA-Detektor wurden auf 227 nm eingestellt, um den Nachweis der drei betrachteten Medikamente zu ermöglichen.

Die vorgeschlagene AQbD-Technik wurde gemäß den ICH-Richtlinien validiert49. Die Ergebnisse der Systemeignungsparameterwerte bei optimalen Trennbedingungen sind in Tabelle S3 dargestellt.

Die etablierte RP-HPLC-Technik wurde in den Bereichen 0,05–30 µg/ml für PIO, 0,05–500 µg/ml für MET und 0,04–20 µg/ml für GLM verwendet, wie in Tabelle 3 dargestellt.

Die Nachweisgrenze und die Quantifizierungsgrenze (LOD und LOQ) wurden unter Bezugnahme auf die Gleichungen bestimmt. (2) und (3); Tabelle 3 zeigt jeweils LOD und LOQ.

Dabei ist b die Steigung der Kalibrierungskurve und Sa die Standardabweichung des y-Achsenabschnitts der Regressionsgeraden.

Die Genauigkeit des vorgeschlagenen Ansatzes wurde durch Berechnung der mittleren prozentualen Wiederfindungen bei drei verschiedenen Konzentrationsniveaus (Dreifachbestimmung) für MET (500, 400 und 250) µg/ml, PIO (15, 12 und 7,5) µg/ml und ermittelt GLM (2, 1,6 und 1) µg/ml (Tabelle S4).

Die Präzision innerhalb eines Tages wurde mithilfe von drei Wiederholungsanalysen bei drei Arzneimittelkonzentrationen am selben Tag bewertet. Die (SD) und (% RSD) wurden für die Ergebnisse der Analyse berechnet, wie in (Tabelle S5) dargestellt.

Die gleichen drei Konzentrationsniveaus jedes Arzneimittels wurden in drei Wiederholungen an drei aufeinanderfolgenden Tagen analysiert. Die (SD) und (% RSD) wurden für die Ergebnisse der Analyse berechnet, wie in (Tabelle S5) dargestellt.

Alle Ergebnisse lagen unter 2, wie in (Tabelle S5) dargestellt, was zeigt, dass die Technik präzise war.

Gemäß den ICH-Richtlinien49 ist die Robustheit eines Analyseprozesses die Fähigkeit der Methodenleistung, von kleinen, aber bewussten Änderungen unbeeinträchtigt zu bleiben. Die Definition von MODR auf der Grundlage des AQbD-Ansatzes hilft bei der Beurteilung der Robustheit und Robustheit der Analysemethode vor der Validierung, da MODR selbst der Bereich ist, in dem die CMPs die CQAs erfüllen.

Robustheitsstudien der etablierten RP-HPLC unter Verwendung der AQbD-Technik wurden unter Verwendung des multivariaten designbasierten Ansatzes durchgeführt, um den Effekt der gleichzeitigen Variation der untersuchten fünf Faktoren (pH, Methanol %, Durchflussrate, Temperatur und Pufferkonzentration) zu untersuchen. auf die ausgewählten Antworten. Für den Robustheitstest wurde ein reguläres faktorielles Screening-Design mit zwei Ebenen (− 1, + 1) aus acht Läufen mit fünf Faktoren verwendet (Tabelle S6), um nur die Haupteffekte der vorgeschlagenen Studienparameter zu untersuchen (bei denen Faktorinteraktionen nicht üblich sind). (Verkürzung der Experimentierzeit) auf die Leistung der HPLC-Methode.

Es wurden geringfügige Änderungen der untersuchten Faktoren vorgenommen. Die Untersuchung der Pareto-Diagramme ergab, dass die Auswirkung aller berücksichtigten Parameter (CMPs) auf die vorab ausgewählten Antworten (CQAs) nicht signifikant war. Dies wurde dadurch bestätigt, dass alle experimentellen t-Werte niedriger als der kritische T-Werte-Grenzwert waren dargestellt in Abb. S6a–g. Die Ergebnisse deuten auf eine gute Stabilität und chromatographische Leistung des etablierten Ansatzes bei kleinen absichtlichen Änderungen seiner (CMPs) hin.

Die Spezifität des etablierten Ansatzes wurde durch den Vergleich der Testergebnisse und Chromatogramme einer simulierten Tablettenlösung, die alle in der Dosierungsform erwarteten Hilfsstoffe enthielt, und einer Lösung, die biologische Plasmamatrizen enthielt, mit denen einer Standardlösung reiner Arzneimittel derselben Konzentrationen nachgewiesen bei den optimalen Trennbedingungen, wie in (Abb. 4a, b) dargestellt.

Chromatogramme für reine Standardarzneimittel (a), im Labor hergestellte Mischung (b) und versetztes Plasma (c).

Zur Abschätzung der Umweltverträglichkeit einer Analysetechnik wurde der analytische Eco-Scale-Ansatz angewendet50. Die Summe der gesamten Strafpunkte wurde für das gesamte Verfahren berechnet. Den berechneten Ergebnissen zufolge weist der validierte Ansatz eine akzeptable Umweltverträglichkeit mit einem analytischen Ökoskalenwert von 73 auf (Tabelle S7).

Der validierte Ansatz wurde angewendet, um gleichzeitig drei verschiedene Konzentrationsniveaus der drei Antidiabetika in den im Labor hergestellten Tabletten im Verhältnis (500:15:2) (MET:LIN:EMP) zu bestimmen. Die %-Erholung, SD und %RSD wurden berechnet und es wurden akzeptable Ergebnisse erzielt (Tabelle 4). Die Ergebnisse des validierten Ansatzes für die drei Konzentrationen der simulierten zubereiteten Tabletten wurden mit denen verglichen, die durch die Anwendung der veröffentlichten RP-HPLC-Technik unter Verwendung eines t-Tests und eines F-Tests mit einem Konfidenzniveau von 95 % hinsichtlich Genauigkeit bzw. Präzision ermittelt wurden. Die berechneten Werte überstiegen nicht die tabellarischen Werte, was einen signifikanten Unterschied zwischen den gemeldeten und den vorgeschlagenen Methoden zeigt, wie in (Tabelle 4) dargestellt.

Die validierte Methode wurde für die gleichzeitige Bestimmung von (MET & GLM) in Amaryl M 2/500 Tabletten (2 mg Glimepirid und 500 mg Metformin) mit der Chargennummer: 2/2024, (PIO & MET) in Bioglita Plus Tabletten (15) angewendet /500) mit Chargennummer: 200061 und (PIO & GLM) in Piompride 30/4 Tabletten, Chargennummer: 191294, AVERROES PHARMA-Ägypten (30 mg Pioglitazon und 4 mg Glimepirid). Die % Erholung, SD und % RSD wurden berechnet und akzeptable Ergebnisse erzielt (Tabelle S8).

Die validierte Methode wurde für die gleichzeitige Quantifizierung von (MET, PIO und GLM) mit 0,1 µg/ml internem LIN-Standard in dotierten Plasmaproben angewendet, wie in (Abb. 4c) dargestellt. Es wurden Kalibrierungskurven aufgezeichnet, die den Bereich von 0,05–2 µg abdecken /ml MET & PIO und 0,04–2 µg/ml GLM. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.

Diese Studie beschreibt eine schnelle, empfindliche und umweltfreundliche RP-HPLC-Methode, die durch die Verwendung des AQbD-Paradigmas zur gleichzeitigen Identifizierung und Schätzung von MET, PIO und GLM in ihrer reinen und im Labor hergestellten Tablette optimiert und validiert wurde. Die Methode wurde erweitert, um die untersuchten Wirkstoffe in dotierten Plasmaproben zu bestimmen. Bei der Entwicklung, Optimierung und sogar bei der Validierung der vorgeschlagenen Methode wurde ein wissenschaftlich organisierter Ansatz verfolgt, bei dem MODR bewertet wurde, um die Anzahl von Ergebnissen außerhalb des Trends zu minimieren, indem der Designbereich bestimmt wurde, in dem alle angegebenen chromatographischen Kriterien erfüllt waren. Aufgrund des hohen Qualitätsniveaus dieser RP-HPLC-Methode eignet sie sich hervorragend für Routineanalysen in Qualitätskontrolllabors und bioanalytische Analysen. Darüber hinaus können die in diesem Dokument erwähnten Verfahren und Details Peer-Experimentatoren dabei helfen, AQbD-basierte Methoden effizient zu erstellen und zu interpretieren.

Alle im Rahmen dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem Artikel enthalten.

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Amira H. Kamal

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Korrespondenz mit Amira H. Kamal.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Marie, AA, Hammad, SF, Salim, MM et al. Ableitung des nutzbaren Designraums der RP-HPLC-Technik zur gleichzeitigen Bestimmung von Metformin, Pioglitazon und Glimepirid. Sci Rep 13, 4334 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30051-x

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Eingegangen: 21. August 2022

Angenommen: 15. Februar 2023

Veröffentlicht: 16. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30051-x

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