DNA

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12429 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Vergiftungstherapie mit Topoisomerase vom Typ II (Top2) wird zur Behandlung eines breiten Spektrums von Krebsarten durch die Induktion von Doppelstrangbrüchen (DSBs) in Zellen eingesetzt, die sich einer Replikation und Transkription unterziehen. Die Verhinderung der Reparatur von DSBs durch Hemmung von DNA-PK, einem Inhibitor der nicht homologen Endverknüpfung (NHEJ), erhöht die Zelltötung durch Top2-Gifte und hat zur Einleitung mehrerer klinischer Studien geführt. Um die zellulären Mechanismen aufzuklären, die zur synergistischen Aktivität der dualen DNA-PK/Top2-Hemmung führen, haben wir ihre Auswirkungen auf zyklische und nicht zyklische Zellen, in 3D-Sphäroiden und in Xenotransplantatmodellen untersucht. Es wurde festgestellt, dass die kombinierte DNA-PK/Top2-Hemmung nicht nur die Zelltötung in proliferierenden Zellen erhöht, der Zellpopulation, die normalerweise am anfälligsten für eine Top2-Vergiftung ist, sondern auch in nicht proliferativen, aber transkriptionell aktiven Zellen. Dieser Effekt wurde sowohl in Krebs- als auch in normalen Gewebemodellen beobachtet und tötete mehr Zellen als hohe Konzentrationen von Etoposid allein. Die Kombinationsbehandlung verzögerte das Tumorwachstum bei Mäusen im Vergleich zur alleinigen Top2-Vergiftung, führte aber auch zu einer erhöhten Toxizität. Diese Ergebnisse zeigen eine Sensibilisierung von Top2β-exprimierenden, nicht zyklischen Zellen gegenüber einer Top2-Vergiftung durch DNA-PK-Hemmung. Die Ausweitung der Zielzellpopulation der Top2-Giftbehandlung auf nicht proliferierende Zellen durch Kombination mit DNA-Schadensreparaturinhibitoren hat Auswirkungen auf die Wirksamkeit und Toxizität dieser Kombinationen, einschließlich der Inhibitoren der DNA-PK, die sich derzeit in der klinischen Prüfung befinden.

Topoisomerase II (Top2)-Enzyme modulieren die Topologie der DNA während der Replikation, Transkription, Chromosomentrennung und DNA-Rekombination. Merkmale von DNA-Strukturen wie Supercoiling, Verkettung und Verknotung machen sie für kritische DNA-verarbeitende Enzyme schlecht zugänglich. Dies wird durch die Top2-Bindung gelöst, die die DNA-Helix vorübergehend schneidet und so die komplexen Strukturen „entwirrt“1. Das Potenzial, diese vorübergehenden Unterbrechungen in dauerhafte DSBs umzuwandeln, macht Top2 zu einem attraktiven Ziel für die Krebstherapie. Tatsächlich sind DNA-Topoisomerasen die molekularen Ziele für mehrere Chemotherapeutika, die zur Behandlung solider und hämatologischer Malignome eingesetzt werden.

Die Mechanismen und Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von Top2-zielgerichteten Antikrebsmitteln wurden kürzlich von Buzun et al.2 überprüft. Top2-Gifte, einschließlich der klinisch aktiven Medikamente Etoposid und Doxorubicin, binden an den kovalenten Top2-DNA-Komplex und stabilisieren ihn während der Replikation und Transkription und verhindern die erneute Ligation gebrochener DNA-Enden. Es gibt zwei Top2-Isoformen, Top2α und Top2β, die beim Menschen eine ähnliche Primärstruktur aufweisen. Während beide Isoformen für die Chromosomentrennung und DNA-Rekombination notwendig sind, wird Top2α in proliferierenden Zellen stark exprimiert, um die DNA-Replikation zu steuern3, während Top2β eine dominantere Rolle bei der Transkription spielt und allgegenwärtig exprimiert wird4. Wenn sie von Top2-Giften eingefangen werden, erzeugen beide Isoformen DNA-DSBs. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass Top2α das primäre Isoform-Ziel für die durch Top2-Gifte vermittelte Zellzytotoxizität ist, da Top2β-Knockdown/Knockout-Zelllinien keinen signifikanten Effekt auf Etoposid IC505 zeigen. Top2α ist das primäre molekulare Ziel für die Top2-Giftaktivität und die Top2α-Expressionsniveaus werden als prognostischer Biomarker für das Screening von Krebspatienten verwendet, die für eine Top2-Giftbehandlung geeignet sind6. Daher sind proliferierende Zellen, die Top2α exprimieren, am anfälligsten für die Behandlung mit Top2-Gift, obwohl DNA-DSBs auch in zusätzliche Populationen eingeführt werden, in denen andere Top-2-Isoformen aktiv sind.

Die beiden primären DNA-DSB-Reparaturwege sind die nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR). HR tritt in späten S/G2-Phasen auf, wenn Schwesterchromatiden als Sequenzvorlage für die Reparatur zur Verfügung stehen und folglich eine Rolle bei der Reparatur replikationsabhängiger DNA-DSBs spielen, die durch eine Vergiftung der Top2α-Isoform vermittelt werden. NHEJ tritt während des gesamten Zellzyklus auf und repariert DNA-Brüche, indem es die beiden gebrochenen DNA-Enden miteinander verbindet. Insgesamt ist NHEJ der vorherrschende DNA-DSB-Reparaturweg in Säugetierzellen, mit einer besonders entscheidenden Rolle für Zellen in nicht proliferierenden Stadien des Zellzyklus7. DNA-abhängige Proteinkinase (DNA-PK), ein Mitglied der Familie der Phosphatidylinositol-3-Kinase-verwandten Kinasen (PIKK), wurde als Schlüsselkomponente des NHEJ-Signalwegs identifiziert und ist daher ein neues Ziel für die therapeutische Entwicklung8.

Kürzlich haben zwei DNA-PK-Inhibitoren in präklinischen Modellen eine sensibilisierende Wirkung mit Top2-Giften gezeigt.9,10,11,12 Beide Verbindungen haben klinische Studien durchlaufen: der klinische Kandidat M3814 von Merck mit Etoposid und Cisplatin (NCT03116971) und die Verbindung von Astra-Zeneca AZD7648 mit pegyliertem liposomalem Doxorubicin (PLD) (NCT03907969). Präklinische Bemühungen identifizierten in vitro und in Tiermodellen verbesserte krebshemmende Wirkungen der Kombination, ohne die Zielzellpopulationen, die durch die DNA-PK-Inhibitoren gegenüber Top2-Giften sensibilisiert wurden, oder den Mechanismus für diese Empfindlichkeit speziell zu untersuchen. Angesichts der breiten Zellpopulation, die auf die Top2-Aktivität angewiesen ist, um den Zugang zur DNA zu erleichtern, und die alle Ziele für die Bindung von Top2-Giften sind, ist es plausibel, dass die Hemmung der Reparatur der durch Top2-Gifte verursachten Schäden zu einer Toxizität für weitere Zellpopulationen führen kann im Vergleich zu den Top2α-zielenden Wirkungen von Top2-Giften allein. Erkenntnisse aus Proteomik-Ansätzen haben gezeigt, dass sowohl DNA-PK als auch Top2β an der Regulierung der Genaktivierung über die Bindung an Transkriptionsfaktoren beteiligt sind13,14,15, was eine zusätzliche Begründung für die Untersuchung der Auswirkungen der Top2-Vergiftung in Kombination mit der DNA-PK-Hemmung in Zellen darstellt Transkription unterzogen.

Wir stellten die Hypothese auf, dass DNA-PK eine Schlüsselrolle bei der Reparatur transkriptionsabhängiger DNA-DSBs spielt, wenn Top2β von Top2-Giften angegriffen wird. Die Auswirkung der Zugabe von DNA-PK-Inhibitoren wäre eine Sensibilisierung nichtproliferativer, aber transkriptionell aktiver Zellen, wodurch die durch die Top2-Giftbehandlung abgetötete Zellpopulation vergrößert würde. Anhand experimenteller Modelle, darunter Krebs- und normale Gewebezelllinien, 3D-Sphäroide und Maus-Xenotransplantate, untersuchten wir die Auswirkungen von Top2-Giften allein oder in Kombination mit den DNA-PK-Inhibitoren AZD7648 und M3814. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Hemmung der DNA-PK zu einer Verstärkung der DNA-Schädigung und der Zelltötung in nicht proliferierenden, aber transkriptionell aktiven Krebszellen sowie in normalen Gewebezellen führt, die mit Top2-Giften behandelt wurden. Es werden signifikante Auswirkungen der Kombination auf das Tumorwachstum beobachtet, allerdings wurde in Mausmodellen eine dosislimitierende Toxizität beobachtet, was auf mögliche Einschränkungen dieser Kombination hindeutet.

HCT-116 (ATCC-ID: CCL-247), A549 (ATCC-ID: CCL-185), FaDu (ATCC-ID: HTB-43), SiHa (ATCC-ID: HTB-35), U87 (ATCC-ID: HTB-14 ) und BT474-Zellen (ATCC-ID: HTB-20) wurden von ATCC erhalten. HCT-116 PRKDC–/– wurde von Thermo Fisher (Kat.-Nr. A29442) erworben; HCT-116 BRCA2–/– wurde von Samuel Aparicio am BC Cancer Research Institute16 erhalten; 48BR (CVCL-4T39) war ein freundliches Geschenk von Dr. Peggy Olives Labor am BC Cancer Research Institute. Alle Zelllinien werden in MEM-Medium (Gibco) gehalten, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Gibco) und 1 % (v/v). Penicillin/Streptomycin (Gibco). Die Zellen wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 kultiviert und bei einer Konfluenz von etwa 90 % routinemäßig passagiert.

Etoposid wurde von Teva gekauft (DIN: 02080036) und vor der Verwendung in Kochsalzlösung verdünnt. Pegyliertes liposomales Doxorubicin (PLD) wurde von Taro (DIN: 02493020) bezogen. AZD7648 (Kat.-Nr. HY-111783) und M3814 (Kat.-Nr. HY-101570) wurden von MedChemExpress erworben und in 1 % Hydroxypropylmethylcellulose/0,6 % Tween80 formuliert.

Das Fortschreiten des Zellzyklus und die DNA-Schädigung wurden in A549-Zellen nach der Behandlung mit Etoposid und DNA-PK-Inhibitor zu den angegebenen Zeiten überwacht. Die Zellen wurden 15 Minuten lang in 10 % Formalin (Fisher Scientific) in PBS fixiert und 30 Minuten lang mit 1 % Triton X-100 (BioShop Canada Inc) in PBS bei 4 °C permeabilisiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und über Nacht bei 4 °C in PBS mit 0,1 % BSA (BioShop Canada Inc) und γH2AX-Antikörpern (Verdünnung 1:1000; EMD Millipore Corp, Kat.-Nr. 05-636) inkubiert. Der Alexa Fluor 647-Antikörper (Verdünnung 1:2000; Invitrogen, Katalog-Nr. A21245) wurde zum Markieren von γH2AX-Antikörpern verwendet und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden 30 Minuten lang in 50 μg/ml Propidiumiodid (Sigma-Aldrich) und 100 μg/ml RNase A (Invitrogen) inkubiert und 104 Zellen pro Probe wurden dann auf einem BD LSR FORTESSA (BD Bioscience) Durchflusszytometer unter Verwendung von 532 und analysiert Anregungen bei 635 nm. Fluoreszenzemissionen wurden mit 585/42-nm- und 661/16-nm-Filtern gesammelt. Für die Datenanalyse wurde die Software Flowjo (BD Bioscience) verwendet.

Einschichtige Zellen wurden mit 0,25 % Trypsin-EDTA (Gibco) geerntet und mit 4–8 × 103 Zellen/Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit MEM-Medium mit oder ohne 10 % FBS inkubiert und dann wurden verschiedene Dosen von Etoposid und DNA-PK-Inhibitoren verwendet, um entweder serumarme oder normal konditionierte Zellen 24 Stunden lang zu behandeln. Behandelte Zellen wurden gewaschen und mit Trypsin-EDTA geerntet und dann in 96-Well-Platten in drei verschiedenen Verdünnungen (100 Zellen/Well, 500 Zellen/Well und 2500 Zellen/Well) ausgesät. Nach 4-tägiger Inkubation wurden die Kolonien in 1 % Formalin fixiert und 2 Stunden lang mit 10 µl/ml Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. B2261) gefärbt. Bilder jeder Vertiefung wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 4-facher Vergrößerung aufgenommen und die Kolonien wurden mit der Image J-Software (National Institute of Health) mit benutzerdefinierten Algorithmen gezählt.

3D-Sphäroide wurden in großen Mengen unter Verwendung von 500-ml-Magna-Flex-Spinnerkolben (Wheaton) gezüchtet, die konstant bei 100 U/min gerührt wurden. Das Wachstum dauerte etwa 3 Wochen, um bei einer anfänglichen Aussaatzahl von 5 × 106 Zellen einen Durchmesser von 400–500 µm zu erreichen. Sphäroide wurden in MEM-Medium mit 5 % FBS, 10 mM Glucose (Gibco) und Penicillin/Streptomycin gezüchtet. Während der Kulturperiode wurde das Medium alle 3–7 Tage gewechselt. Die Flaschen wurden in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 aufbewahrt.

Als die Sphäroide einen Durchmesser von ~ 400 µm erreichten, wurden sie gesammelt und in 2 ml große 96-Well-Polypropylenplatten (Axygen) verteilt. Abgesetzte Sphäroide wurden in Volumina von 3–5 µL in 1,2 ml arzneimittelhaltiges Medium dispensiert, um 5–10 Sphäroide pro Vertiefung zu erhalten, wobei eine Spitze mit breiter Bohrung (Perkin Elmer, Wide Bore-P235) und ein automatisierter 96-Kanal-Liquid-Handler (PerkinElmer, Evolution P3). Vor der Zugabe von Sphäroiden wurden Platten mit mehreren Vertiefungen mit den gewünschten Arzneimittelverdünnungen ausgestattet. Die Platten wurden dann mit einer Silikonkautschukmatte (Axygen) in einer Handschuhbox (Hypoxygen) bei kontrollierter Begasung von 5 % CO2, 20 % O2 versiegelt. Nach dem Versiegeln der Platten wurden diese dann kontinuierlich gedreht (20 U/min), wobei die Platten auf ihre Seiten ausgerichtet und geneigt waren, um die eingeschlossene Luftblase zum Mischen zu nutzen und die Sphäroide in einem frei fallenden Zustand zu halten. Sphäroide wurden bis zu 24 Stunden lang Etoposid-Inhibitoren ausgesetzt, bevor sie für Kryoschnitte oder Zellüberlebensendpunkte gesammelt wurden.

Nach der angegebenen Behandlung wurden die Sphäroide 2 Stunden lang entweder mit 100 µM 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin (EdU) (Gold Biotechnology) zur Replikation oder 1000 µM 5-Ethinyluridin (EU) (Carbosyth China Ltd) zur vorherigen Transkription inkubiert zur Sammlung für Kryoschnitte und klickbasierte Färbung. Mit einem 96-Kanal-Pipettierkopf wurden Sphäroide gleichzeitig aus allen 96 Vertiefungen gesammelt, absetzen gelassen und dann als flüssigkeitsfreie Häufchen auf einer gedehnten 13 × 13 cm großen Latexfolie (Rite Dent) verteilt, so dass sich der Bereich beim Entspannen zusammenzog Größe einer 96-Well-Platte (7,5 × 13 cm) bis hin zu einem Objektträger (~ 2,5 × ~ 3,8 cm). Die resultierenden Sphäroid-Mikroarrays wurden dann sofort über einen – 30 °C warmen Aluminiumblock eingefroren, der unter der entspannten Latexfolie platziert und in OCT-Schnittmedium (Fisher Scientific) eingebettet wurde.

Nach der angegebenen Behandlung wurden die Sphäroide gesammelt und in frische, wirkstofffreie Medien überführt. Die Sphäroide wurden vor der 20-minütigen Inkubation mit 0,25 % Trypsin-EDTA (Gibco) unter kontinuierlichem Rühren bei 37 °C dreimal mit PBS gewaschen. Nach der Dissoziation wurden die Zellsuspensionen in frischem Medium mit 10 % FBS weiter verdünnt. Zellsuspensionen wurden dann entweder unter Verwendung von 6-cm-Gewebekulturplatten (Sarstedt, Deutschland) für Experimente, die eine Zellabtötung von mehr als 90 % ergaben, oder unter Verwendung klarer Polystyrol-Zellkulturplatten mit flachem Boden und 96 Vertiefungen (Corning, Costar 3595) für Experimente mit geringer Zellabtötung ausplattiert. Die 96-Well-Kolonieplatten wurden dann 45 Minuten lang stehen gelassen, bevor sie in einen befeuchteten Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 gelegt wurden, um das Absetzen der Zellen zu ermöglichen, andernfalls würde es zu einer ungleichmäßigen Kolonieverklumpung in den äußeren Wells kommen. Nach dem Ausplattieren der Kolonien wurden die ursprünglichen Zellsuspensionen dann doppelt gezählt, indem 25-µl-Aliquots aus jeder Vertiefung in zusätzlichen 96-Well-Platten aus durchsichtigem Polystyrol mit flachem Boden verdünnt wurden, die 25 µl Hoechst 33342 (10 µl/ml Endkonzentration) und Propidiumiodid enthielten ( 4 µl/ml Endkonzentration). Man ließ die Zellsuspensionen 30 Minuten lang absetzen, bevor sie mit einem Fluoreszenzmikroskop zur anfänglichen Zählung lebender/toter Zellen abgebildet wurden. Mithilfe der Zellzahlen wurde dann die tatsächliche Anzahl der in den einzelnen Vertiefungen ausplattierten Zellen berechnet. Um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen, wurden die Zählungen in 2-facher Wiederholung durchgeführt. Platten mit 96 Vertiefungen wurden 4 Tage lang inkubiert, anschließend in 1 % Formalin fixiert und 2 Stunden lang mit Hoechst 33342 gefärbt. Anschließend wurden Bilder jeder Vertiefung mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 4-facher Vergrößerung aufgenommen und die Kolonien mit der Image J-Software gezählt mit benutzerdefinierten Algorithmen. 6-cm-Platten wurden 12 Tage lang inkubiert, um die Koloniebildung zu ermöglichen, und dann mit 2 g/L Malachitgrün (Sigma-Aldrich) in Wasser gefärbt und manuell gezählt.

Alle Studien mit Mäusen wurden im BC Cancer Research Institute Animal Resource Centre durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of British Columbia gemäß dem genehmigten Tierstudienprotokoll A21-0059 genehmigt. Alle Tiere wurden gemäß den ethischen Richtlinien des Canadian Council on Animal Care behandelt und werden gemäß den ARRIVE 2.0-Richtlinien gemeldet. Rag2M-Mäuse wurden ursprünglich von Taconic Biosciences gekauft.

Für Studien zur Verzögerung des A549-Tumorwachstums wurden 106 A549-Zellen in einem Volumen von 50 μl in den Gastrocnemius-Muskel von 61 10–13 Wochen alten männlichen Rag2M-Mäusen inokuliert, einschließlich einer Überdosierung von 20 %, um unterschiedliche Tumorwachstumsraten zu berücksichtigen. Wenn das mittlere Tumorvolumen der Kohorte 150 mm3 überstieg, wurden die Tiere nach Tumorvolumenbereichen geschichtet; Tiere mit den kleinsten Tumorvolumina wurden von der Studie ausgeschlossen (n = 13). Die übrigen Tiere (Kohortengröße n = 48, 30 für Etoposid-Tumorwachstumsverzögerung und 18 für PLD-Wachstumsverzögerung) hatten alle Tumorvolumina im Volumenbereich von 160–225 mm3. Die Tiere wurden mittels stratifizierter Randomisierung und einem Zufallszahlengenerator Behandlungsgruppen zugeordnet, um sicherzustellen, dass jeder Gruppe ein Bereich von Tumorvolumina zugewiesen wurde. Es wurden keine Leistungsberechnungen a priori durchgeführt. Aufgrund früherer Beobachtungen einer konsistenten Tumorreaktion auf Chemotherapie und Sensibilisierungsreaktionen durch DNA-Schadensreparaturinhibitoren ohne zahlreiche Ausreißer oder Anomalien wurde für diese Studie eine Probengruppengröße von n = 6 als angemessen ermittelt. Es wurden erhebliche Morbiditäten beobachtet, die aufgrund des erheblichen Gewichtsverlusts in bestimmten Behandlungsgruppen humane Endpunkte für den Abbruch erforderten; Eine größere Stichprobengröße hätte dieses Ergebnis nicht verbessert.

Etoposid wurde 3 Wochen lang an den Tagen 0, 1 und 2 jeder Woche intraperitoneal (ip) mit 5 mg/kg verabreicht. Pegyliertes liposomales Doxorubicin (PLD) wurde 3 Wochen lang einmal pro Woche durch intravenöse (iv) Injektion mit 6 mg/kg verabreicht. AZD7648 wurde über eine orale Sonde (po) mit 10, 30 oder 100 mg/kg gleichzeitig in Kombination mit Top2-Giften verabreicht. Den Kontrollgruppen wurde ein äquivalentes Volumen an Arzneimittelträger verabreicht. Die Tumorgröße und das Gewicht der Mäuse wurden dreimal pro Woche überwacht, wobei das Tumorvolumen mit Messschiebern gemessen und unter Verwendung der Formel V = π/6 (L × H × B) berechnet wurde. Die Messungen wurden mit einem blinden Rekorder durchgeführt. Mäuse wurden am Ende des Experiments eingeschläfert, wenn das Tumorvolumen 1000 mm3 erreichte, oder am humanen Endpunkt, einschließlich der Tiere, deren Gewicht mehr als 20 % gegenüber der Zeit vor der Behandlung verloren hatte. In den Studienergebnissen wird über Tiere berichtet, die aufgrund des humanen Endpunkts eingeschläfert werden mussten. Alle Tiere wurden unter den gleichen Haltungs- und Haltungsbedingungen gehalten, wobei allen Versuchsmäusen während des Behandlungszeitraums Teigfutterzusätze zur Verfügung gestellt wurden.

Für immunhistochemische Studien wurden insgesamt 18 Mäuse verwendet. Es wurden keine Leistungsberechnungen a priori durchgeführt. Aufgrund früherer Beobachtungen einer konsistenten Tumorreaktion mit dem EdU-Assay ohne zahlreiche Ausreißer oder Anomalien wurde für diese Studie eine Stichprobengröße von n = 6 als angemessen ermittelt. Ganze Kryoschnitte von Tumorproben werden analysiert, um einen robusten Datensatz zu erstellen. 106 FaDu-Zellen wurden in den Gastrocnemius von 13 Wochen alten männlichen Rag2M-Mäusen injiziert und auf ein Volumen von mindestens ~ 300 mm3 gezüchtet. Etoposid (40 mg/kg ip) ± AZD7648 (30 mg/kg po) wurden 24 Stunden vor der Tumorernte verabreicht. 2 Stunden vor der Gewebeentnahme wurde EdU verabreicht (60 mg/kg ip). Nach der Exzision wurden die Tumoren auf einem Aluminiumblock auf –20 °C abgekühlt und mit OCT-Einbettungsmedium (Tissue-TEK OCT) bedeckt.

Tumor- oder Sphäroid-Kryoschnitte (10 µm dick) wurden mit einem Kryostat Cryostar HM560 (Microm International GmbH) geschnitten, sofort 15 Minuten lang in 10 % phosphatgepuffertem Formalin fixiert und dann auf PBS + 0,1 % Tween 20 (PBST) übertragen. Das Gefäßsystem wurde unter Verwendung eines CD31-Antikörpers (Verdünnung 1:500; BD Pharmingen, Katalog-Nr. 553370) 1 Stunde lang gefärbt, gefolgt von 1:500 Alexa-Anti-Ratte 488 nm sekundär (Invitrogen, Katalog-Nr. A11006) 30 Minuten lang. Der DNA-Schaden wurde mit 1:500 p53BP1-Antikörper (Cell Signaling, Katalog-Nr. 2675S) 1 Stunde lang gefärbt, gefolgt von 1:500 Alexa-anti-Ratte 647 nm Sekundär (Invitrogen, Katalog-Nr. A21472) 30 Minuten lang. Top2 wurde mit 1:500 Top2α-Antikörper (Novus, Katalog-Nr. NBP2-53281) oder Top2β-Antikörper (Novus, Katalog Bo NBP1-89527) 1 Stunde lang gefärbt, gefolgt von 1:500 Alexa-Anti-Kaninchen 488 nm Sekundär ( Invitrogen, Katalog-Nr. A11034) für 30 Minuten. Für den EdU- und EU-Nachweis wurden die Objektträger erneut 10 Minuten lang in 10 % Formalin fixiert, bevor EdU/EU mit einem Click-Chemie-Cocktail gefärbt wurde: L-Ascorbinsäure (100 mM), CuSO4 (4 mM) und Sulfo-Cy3-Azid (5 µM) (Sigma-Aldrich) zusammen mit dem Kernmarker Hoechst 33342 (20 µg/ml) für 30 Minuten. Alle Verdünnungen wurden in PBST durchgeführt. Anschließend wurden die Objektträger 30 Minuten lang gewaschen und vor der Bildgebung mit PBS eingedeckt.

Die Objektträger wurden auf ein speziell angefertigtes Bildgebungssystem geladen, ein Nikon Plan Fluorite Imaging 10×-Objektiv (Nikon), eine gekühlte PCO Edge 4.2 sCMOS-Kamera (PCO), die mit benutzerdefinierten Algorithmen in der ImageJ-Software (ImageJ, https://imagej.nih) ausgeführt wurde .gov/ij/). Mit diesem System wurden Bilder ganzer Objektträger mit einer Auflösung von 0,65 µm/Pixel aufgenommen.

Unter Verwendung der ImageJ-Softwareanwendung und vom Benutzer bereitgestellter Algorithmen wurden Bilder der CD31-Fluoreszenz, 53BP1, EdU und Hoechst 33342 aus jedem Tumorabschnitt überlagert, Tumorgrenzen beschrieben und Bereiche mit Nekrose und Färbungsartefakten entfernt (Falten, Risse, Ablagerungen usw.). ). CD31-positive Objekte wurden dann auf der CD31-Bildschicht anhand eines Schwellenwerts identifiziert, der 10 Standardabweichungen über den Gewebehintergrundwerten lag. CD31-Objekte mit einer Größe von weniger als 10 µm2 wurden als Artefakte betrachtet und aus der Analyse ausgeschlossen. Anschließend wurde eine Analyse durchgeführt, um den Abstand von jedem Punkt im Gewebe zum nächstgelegenen CD31-positiven Objekt zu messen und dessen Intensität zu notieren, um dann die Beziehung zwischen der Proliferation oder dem 53BP1-Signal als Funktion des Abstands zum nächstgelegenen Blutgefäß zu bestimmen. Die Daten wurden tabellarisch aufgeführt, um das Profil der EdU- und 53BP1-Färbung im Verhältnis zum Abstand zu Blutgefäßen zu bestimmen, oder es wird die durchschnittliche Intensität der Pixel für p53BP1 angegeben. Ein ähnlicher Ansatz wurde für die Sphäroidanalyse gewählt, wobei die äußere Sphäroidkante als Referenzpunkt und nicht die CD31-Objekte verwendet wurde.

Alle statistischen Analysen wurden mit der Graphpad Prism-Software (Version 9.3) durchgeführt. Die Überlebenskurven der Arzneimitteldosis-Wirkungs-Überlebenskurven wurden mit nichtlinearen Regressionskurvenanpassungstools in Prism unter Verwendung des Modells „Absolute IC50, X ist logarithmisch (Konzentration)“ angepasst. Die Überlebensübersicht und die Etoposid-pIC50-Balkendiagramme wurden mittels ungepaarter, zweiseitiger T-Tests bewertet. Die Zeit bis zur Verdreifachung des Tumorvolumens wurde für alle Gruppen mittels ANOVA und anschließenden Mehrfachvergleichstests in der Türkei ermittelt. Die Analyse des prozentualen Gewichtsverlusts der Maus am Tag 7/14 wurde mit dem ANOVA Kruskal-Wallis-Test bewertet. Tumor-p53BP1-Signalintensitätsanalysen wurden über ungepaarte zweiseitige T-Tests durchgeführt. Sphäroide p53BP1-Signalintensitätsanalysen erfolgten mittels ANOVA, gefolgt von Tukey-Mehrfachvergleichstests. Berechnete p-Werte werden als *p \(\le\) 0,05 angegeben; **p \(\le\) 0,01; ***p \(\le\) 0,005; ****p \(\le\) 0,001.

3D-Sphäroid-Gewebemodelle rekapitulieren die Sauerstoff- und Nährstoffgradienten der Mikroumgebung des soliden Tumors und führen so zu einer gemischten Zellpopulation, die im Vergleich zur Monoschichtkultur, in der proliferierende Zellen eher die Reaktion auf Etoposid dominieren, einen größeren Anteil nicht proliferierender ruhender Zellen enthält Behandlung17. Im 3D-Sphäroidmodell weist die Behandlung mit Etoposid eine Dosis-Wirkungs-Beziehung auf, die über etwa 10 µM hinaus gesättigt ist, wobei etwa 40 % der Zellen selbst bei 10-fach höheren Dosen überlebten (Abb. 1). Um die Rolle von HR und NHEJ bei der Sensibilisierung der Sphäroide für durch Top2-Gift verursachte DNA-Schäden aufzuklären, führten wir klonogene Überlebenstests an HCT-116-Sphäroiden durch, denen entweder HR (BRCA2–/–) oder NHEJ (PRKDC–/–) fehlten Etoposid-Exposition. Nach 24 Stunden zeigen HR-defiziente Sphäroide ein ähnliches Etoposid-Empfindlichkeitsprofil im Vergleich zu Wildtyp-HCT-116-Sphäroiden mit etwa 60 % Zelltötung, was mit der selektiven Ausrichtung auf die S-Phasen-Fraktion innerhalb der Sphäroide übereinstimmt18, während NHEJ-defiziente Sphäroide ~ aufwiesen 4 Protokolle zusätzlicher Zelltod. Die Zugabe von 1 µM DNA-PK-Inhibitor M3814 erhöhte die Zelltötung in Wildtyp-Sphäroiden um den Faktor 10 im Vergleich zur alleinigen Etoposid-Behandlung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass NHEJ der Hauptreparaturweg für Etoposid-induzierte DNA-Schäden ist und dass die DNA-PK-Hemmung Zellsphäroide wirksamer sensibilisieren kann als höhere Konzentrationen von Etoposid allein.

Die Aufhebung des NHEJ-Reparaturwegs, jedoch nicht der HR, sensibilisiert 3D-Tumorsphäroide für Etoposid, das bei 50 % Zelltötung gesättigt ist. Klonogene überlebende Fraktion ± SD von HCT-116-Wildtyp-, BRCA2–/–- und PRKDC–/–-Sphäroiden, behandelt mit Etoposid (0, 3, 10, 30, 100 µM) für 24 Stunden.

Die Wirkung der DNA-PK-Hemmung in Kombination mit Top2-Giften wurde mittels klonogener Überlebenstests bewertet, die an einschichtigen Zellkulturen durchgeführt wurden, die mit den Etoposid-DNA-PK-Inhibitoren AZD7648 oder M3814 behandelt wurden. Dosis-Wirkungs-Kurven für FaDu-Zellen (Abb. 2A, linkes Feld) zeigen, dass eine Monotherapie mit AZD7648 oder M3814 bis zu 10 µM keinen Einfluss auf das Überleben hatte, jedoch zeigte 1 µM eines der DNA-PK-Inhibitoren in Kombination mit Etoposid eine signifikante Verringerung des Zellüberlebens im Vergleich zu Etoposid allein. Diese Daten wurden verwendet, um die in Abb. 2A (rechtes Feld) gezeigten Etoposid-IC50-Werte für FaDu und weitere Zelllinien zu berechnen, wobei die Werte für 1 µM AZD7648 + Etoposid im Vergleich zum Top2-Gift allein durchweg niedriger waren, was darauf hindeutet, dass DNA-PK-Inhibitoren die Monoschicht sensibilisieren Tumorzellen gegenüber Etoposid um mindestens den Faktor 10.

DNA-PK-Inhibitoren sensibilisieren einschichtige Zellkulturen für die Behandlung mit Etoposid. (A) Klonogenes Überleben von Krebszelllinien, die 24 Stunden lang mit Etoposid ± 1 µM AZD7648 oder 1 µM M3814 behandelt wurden (Mittelwert ± SD). Die Überlebenskurve der allein verabreichten FaDu-Zellen, AZD7648 und M3814 ist dargestellt (linkes Feld). IC50 ± SD von HCT-116-, A549-, FaDu- und SiHa-Zelllinien, behandelt mit Etoposid ± 1 µM AZD7648 für 24 Stunden (rechtes Feld). Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt. Die Zugabe von AZD7648 verringerte den IC50-Wert von Etoposid signifikant (HCT-116: p ≤ 0,005, A549: p ≤ 0,0001, FaDu: p ≤ 0,0001, SiHa: p ≤ 0,005). (B) Bewertung der DNA-Schädigung und des Zellzyklus von A549-Zellen durch p53BP1 und Propidiumiodid (PI) Dual-Färbetest nach 6-stündiger Behandlung mit 10 µM Etoposid ± 1 µM AZD7648 oder Vehikel. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt. Repräsentative Gegendiagramme von A549-Zellen unter Kontrollbedingungen, Etoposid allein und Etoposid + AZD7648-Behandlungsbedingungen (linkes Feld). Die Zahl (Feld) stellt den Prozentsatz der gesamten Zellen dar. Zellzyklusspezifisches relatives p53BP1-Immunfluoreszenzverhältnis von Etoposid- und Etoposid + AZD7648-Gruppen gegenüber einer Kontrollgruppe (rechtes Feld). Der Unterschied ist nur in der G1-Population statistisch signifikant (p ≤ 0,01). (C) Bewertung der DNA-Schädigung und des Zellzyklus von 48BR-Zellen durch p53BP1 und Propidiumiodid (PI) Dual-Färbetest nach 4-stündiger Behandlung mit 10 µM Etoposid ± 1 µM AZD7648 oder Vehikel. Die Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt. Das zellzyklusspezifische relative p53BP1-Immunfluoreszenzverhältnis der Etoposid- und Etoposid + AZD7648-Gruppen wird gegenüber einer Kontrollgruppe gezeigt. Die Unterschiede sind für alle Phasen statistisch signifikant, mit der größten Größenänderung in G1 (G1: p ≤ 0,005; S: p ≤ 0,01; G2: p ≤ 0,05). (D) Analyse der FaDu-Zellzyklusverteilung unter Verwendung von Propidiumiodid nach 24 Stunden Serummangel. Die Zahlen (über den Torbalken) geben den Prozentsatz der gesamten Zellen an. (E) Klonogene überlebende Fraktion ± SD von Krebszelllinien, die 24 Stunden lang unter serumarmen Bedingungen mit Etoposid ± 1 µM AZD7648 behandelt wurden. Überlebenskurve serumarmer FaDu-Zellen unter Etoposid/Etoposid + AZD7648-Behandlung. Es wurde auch die alleinige Behandlung mit Etoposid unter normalen Bedingungen (ohne Serummangel) gezeigt (linkes Feld). IC50 ± SD von HCT-116-, A549-, FaDu- und SiHa-Zelllinien, behandelt mit Etoposid ± 1 µM AZD7648 unter Serummangel für 24 Stunden (rechtes Feld). Die IC50-Unterschiede zwischen den Gruppen Etoposid und Etoposid + AZD7648 sind statistisch signifikant (HCT-116: p ≤ 0,005, A549: p ≤ 0,0001, FaDu: p ≤ 0,0001, SiHa: p ≤ 0,0001).

Das Ausmaß der DNA-Schädigung, die Zellen in den Stadien G1, S und G2 des Zellzyklus erlitten haben, wurde mithilfe der Durchflusszytometrie auf der Grundlage der Propidiumiodid (PI)-Färbung und der Analyse der p53BP1-Färbung nach der Behandlung mit Etoposid ± DNA-PK-Inhibitor AZD7648 ermittelt. Die Ergebnisse in A549-Zellen (Abb. 2B) zeigen einen Anstieg der p53BP1-Signalintensität für mit Etoposid + AZD7648 gleichzeitig behandelte Zellen (78,4 % der Zellen sind positiv) im Vergleich zu Etoposid allein (55 % der Zellen sind positiv). Eine zellzyklusspezifische Analyse weist auf einen signifikanten Anstieg des DNA-Schadens für die Kombination im Vergleich zu Etoposid allein für die G1-Zellpopulation hin, mit geringeren Veränderungen bei den proliferierenden S- und G2-Zellpopulationen. Ähnliche Ergebnisse werden bei 48BR-Zellen (menschliche Hautfibroblasten) beobachtet, bei denen diese normalen Zellen bei der Behandlung mit Etoposid + AZD7648 im Vergleich zu Etoposid allein deutlich mehr DNA-Schäden erlitten, wobei die größten Auswirkungen in der G1-Phase zu verzeichnen waren (Abb. 2C).

Die Auswirkung der Etoposid-DNA-PK-Hemmung auf nicht proliferierende Zellen wurde mithilfe eines klonogenen Überlebenstests an serumarmen Zellen bewertet. Einschichtige FaDu-, SiHa-, HCT-116- und A549-Zellen wurden 24 Stunden lang in serumfreien Medien inkubiert, was dazu führte, dass sich über 70 % der Zellen in der G0/1-Phase befanden (FaDu-Zelllinie in Abb. 2D dargestellt). Anschließend wurden klonogene Überlebenstests sowohl an serumarmen als auch an nicht hungernden Zellen durchgeführt, um Dosis-Wirkungs-Kurven für Etoposid (2,5 nM–50 µM) ± 1 µM AZD7648 für 24 Stunden zu erstellen. Die Ergebnisse zeigen, dass Zellen, denen Serum entzogen wurde, resistenter gegen die Behandlung mit Etoposid sind als Zellen, denen kein Serum verabreicht wurde. Die Zugabe des DNA-PK-Inhibitors AZD7648 resensibilisierte die Zellen, denen Serum entzogen wurde (Abb. 2E, linkes Feld), jedoch in einem ähnlichen Ausmaß wie zuvor in den nicht serumarmen Zellen zu sehen (Abb. 2A, linkes Feld). Diese Ergebnisse wurden in mehreren Zelllinien wiederholt, in denen der IC50-Wert von Etoposid allein durchweg viel höher ist als der von Etoposid in Kombination mit AZD7648 (Abb. 2E, rechte Tafel).

Um die Sensibilisierung von Zellen gegenüber Top2-Giften durch DNA-PK-Hemmung weiter zu untersuchen, haben wir diese Kombinationstherapie in Tumorsphäroiden evaluiert. Wie oben beschrieben, enthalten 3D-Gewebesphäroidmodelle im Vergleich zur Monoschichtkultur einen größeren Anteil nicht proliferierender, ruhender Zellen. Abbildung 3A zeigt eine Dosis-Wirkungs-Überlebenskurve von FaDu-Sphäroiden gegenüber Etoposid. Dies zeigt, dass die Sphäroide im Vergleich zur Monoschichtkultur eine hohe Resistenz gegen Etoposid aufweisen. Die Zugabe von 1 µM M3814 zeigt jedoch eine Sensibilisierung, die über die maximalen Effekte hinausgeht, die mit Etoposid allein beobachtet werden. Ähnliche Ergebnisse werden in weiteren Zelllinien HCT-116, SiHa und A549 gezeigt, wo der überlebende Anteil an Sphäroiden in den Kombinationsbehandlungsgruppen mit 25 µM Etoposid + 1 µM M3814 im Vergleich zu 25 µM Etoposid allein konsistent abnahm.

DNA-PK-Inhibitoren sensibilisieren 3D-Tumorzellsphäroide für die Behandlung mit Etoposid. (A) Klonogenes Überleben von FaDu-Zellsphäroiden, die 24 Stunden lang mit Etoposid ± 1 µM M3814 behandelt wurden (Mittelwert ± SD). (B) Überlebensfraktion von HCT-116-, A549-, FaDu- und SiHa-Sphäroiden, behandelt mit 25 µM Etoposid + 1 µM M3814 für 24 Stunden (Mittelwert ± SD) (p ≤ 0,0001 für alle Zelllinien). Mit Ausnahme der FaDu-Zellen wurden die Experimente mindestens dreimal durchgeführt. (C) Repräsentative Bilder der EdU-, EU-, Top2α- und Top2β-Färbung (rot) in HCT-116-, A549-, FaDu-, SiHa-, U87- und BT474-Tumorzellsphäroiden. Zellkerne wurden mit Hoechst 33342 (grau) gefärbt. (D) Bewertung der EdU- und EU-Signalintensität im Vergleich zur Zelltiefe in unbehandelten HCT-116-Sphäroiden. Gestrichelte Linien stellen einzelne Experimentwiederholungen dar, während durchgezogene Linien Gruppendurchschnitte darstellen. (E) Analyse der p53BP1-Signalintensität (Mittelwert ± SD) in verschiedenen Tiefen in Tumorzellsphäroiden (0–50 µm, 50–100 µm und 100–150 µm). HCT-116-Sphäroide wurden vor dem Kryoschneiden und Färben 6 Stunden lang mit 25 µM Etoposid in Gegenwart von 1 µM M3814, 1 µM AZD7648 oder Vehikel behandelt. Die Zugabe von M3814 und AZD7648 erhöhte beide die p53BP1-Intensität in 50–100 µm- und 100–150 µm-Schichten von Sphäroiden signifikant (p ≤ 0,01 für AZD7648, p ≤ 0,001 für M3814).

Um den möglichen Beitrag der Transkription zur Reaktion der dualen DNA-PK/Top2-Hemmung zu untersuchen, wurde die immunhistochemische Färbung des Transkriptions- und Replikationsstatus als Funktion der Tiefe in die 3D-Sphäroide bewertet und diese Ergebnisse zusammen mit den Top2α- und Top2β-Färbungsprofilen verglichen. DNA-Replikations- und RNA-Synthesemuster wurden durch „Klick“-Chemiefärbung mit EdU bzw. EU sichtbar gemacht19,20. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sowohl die Top2α- als auch die EdU-Färbung auf den Rand der Sphäroide (< 50 µm) beschränkt waren, während die Top2β- und die EU-Färbung allgegenwärtiger waren und sich bis in tiefere Schichten der Sphäroide erstreckten (Abb. 3C, D). DNA-Schäden wurden auch mit p53BP1 in Sphäroiden beurteilt, die mit Etoposid ± DNA-PK-Hemmung behandelt wurden. Wenn Etoposid nur Sphäroiden ausgesetzt wurde, wurde eine p53BP1-Färbung nur in den ersten 50 µm der Sphäroide festgestellt, was mit einer größeren DNA-Schädigung in der proliferierenden Fraktion der Sphäroidzellpopulationen vereinbar ist. Wenn jedoch 1 µM AZD7648 oder M3814 hinzugefügt wurde, wurde p53BP1 weiter in die Sphäroide (50–150 µm) ausgedehnt, wo die DNA-Synthese verringert war oder fehlte, die RNA-Synthese jedoch immer noch aktiv war (Abb. 3E).

Als nächstes testeten wir die Therapie mit Top2-Giften ± DNA-PK-Hemmung an Mäusen, die FaDu- oder A549-Xenotransplantate trugen. Abbildung 4 zeigt die Antitumorwirkung der DNA-PK-Hemmung über AZD7648 mit den Top2-Giften Etoposid oder pegyliertes liposomales Doxorubicin (PLD) in A549-Xenotransplantaten. Die AZD7648-Behandlung allein hatte keine Antitumorwirkung (Abb. 4E). Die relativ niedrige Etoposid-Dosis (5 mg/kg 3x/Woche über 3 Wochen) hatte im Vergleich zu den Vehikelkontrollen nur eine geringe Antitumorwirkung, und die Zugabe der niedrigsten Dosis von AZD7648 (10 mg/kg 3x/Woche über 3 Wochen) erzeugte keine Sensibilisierung. Allerdings wurde bei einer höheren Dosis von AZD7648 (30 mg/kg 3x/Woche für 3 Wochen) mit Etoposid eine signifikante Verzögerung der Zeit bis zum 3-fachen Tumorvolumen beobachtet, die sich auf 28 Tage im Vergleich zu 19 Tagen bei Etoposid allein erstreckte (Abb. 4E). Eine weitere Erhöhung der AZD7648-Dosis auf 100 mg/kg konnte aufgrund der schweren Toxizität des normalen Gewebes nicht abgeschlossen werden, was einen frühen Endpunktabbruch (7 Tage nach der ersten Behandlung) erforderte. Der Gewichtsverlust von Mäusen in den Kombinationsbehandlungsgruppen folgt einem ähnlichen dosisabhängigen Muster wie die wachstumshemmenden Wirkungen, wobei alle Gruppen einen schnellen Gewichtsverlust erlebten und die Gruppe mit der höchsten Kombination von 100 mg/kg AZD7648 über 20 % betrug in der ersten Woche (Abb. 4B,F). Dies steht im Einklang mit der Empfindlichkeit normaler Gewebezellen im Vergleich zu Krebszellen, die bei Monoschichtkulturen gezeigt wurde (Abb. 2C).

Der DNA-PK-Inhibitor AZD7648 verzögert in Kombination mit Top2-Giften das Tumorwachstum. (A) und (C), relative Tumorvolumina (Mittelwert ± SD) des A549-Tumorwachstums aufgetragen gegen die Zeit. Tumortragende Mäuse wurden randomisiert (n = 6 pro Gruppe) mit einem mittleren Tumorvolumen von 185 mm3 (SD = 17,6) bzw. 192 mm3 (SD = 17,6). Für die Etoposid-Behandlung (A) wurden 5 mg/kg Etoposid intraperitoneal verabreicht und AZD7648 wurde oral in Dosen von 10, 30 und 100 mg/kg verabreicht. Für die PLD-Behandlung (B) wurden 6 mg/kg PLD intravenös mit oder ohne 100 mg/kg AZD7648 oral verabreicht. Alle Behandlungen dauerten 3 Wochen. (B) und (D) zeigen die relative Gewichtsveränderung bei Mäusen (Mittelwert ± SD) von A549-tumortragenden Tieren nach Behandlungen mit Etoposid bzw. PLD, aufgetragen gegen die Zeit. (E) Tumorverdreifachungszeit für Mäuse, gezeigt in (A) und (C); Die alleinige Behandlung mit 100 mg/kg AZD7648 wurde in einer separaten Studie durchgeführt. Punkte repräsentieren die einzelnen Mäuse in jeder Gruppe. Es gibt einen signifikanten Anstieg der Tumorverdreifachungszeit für Etoposid + 30 mg/kg AZD7648 (p ≤ 0,05) im Vergleich zu Etoposid allein sowie zwischen PLD und PLD + 100 mg/kg AZD7648 (p ≤ 0,001). (F) Prozentsatz des Gewichtsverlusts der Maus im Vergleich zur Kontrolle (Mittelwert ± SD) am Tag 7 für die Etoposid-Behandlung. Der Unterschied zwischen der Vehikelkontrolle vs. 5 mg/kg Etoposid + 100 mg/kg AZD7648 und den Gruppen 5 mg/kg Etoposid vs. 5 mg/kg Etoposid + 100 mg/kg AZD7648 ist statistisch signifikant (p ≤ 0,01 bzw. p ≤ 0,05). (G) Prozentsatz des Gewichtsverlusts der Maus im Vergleich zur Kontrolle (Mittelwert ± SD) am Tag 14 für die PLD-Behandlung. Der Unterschied zwischen den Gruppen Vehikelkontrolle vs. 6 mg/kg PLD und 6 mg/kg PLD vs. 6 mg/kg PLD + 100 mg/kg AZD7648 ist statistisch signifikant (p ≤ 0,01 bzw. p ≤ 0,05).

A549-tumortragende Tiere, die drei Wochen lang einmal pro Woche mit 6 mg/kg PLD als Einzelwirkstoff behandelt wurden, zeigten im Vergleich zu den Kontrollen eine signifikante Verzögerung des Tumorwachstums, wobei sich die Zeit bis zur Verdreifachung des Tumorvolumens von 19 auf 48 Tage verlängerte (Abb. 4E). Die Zugabe von 100 mg/kg AZD7648 zu PLD verzögerte das Tumorwachstum weiter auf 72 Tage im Vergleich zu 48 Tagen bei PLD als Einzelwirkstoff (Abb. 4E). Sowohl bei PLD allein als auch bei der Kombinationsgruppe wurde eine mäßige normale Gewebetoxizität beobachtet, da alle Mäuse mit Teignahrungsergänzungsmitteln versorgt werden mussten, um in den Behandlungsgruppen einen Gewichtsverlust von 20 % nicht zu überschreiten; Kontrollgruppen nahmen mit der Teigdiät zu (Abb. 4D, G). Ähnliche Ergebnisse werden auch bei FaDu-Xenotransplantaten beobachtet (Daten nicht gezeigt).

Wir führten eine immunhistochemische Färbung und Analyse von FaDu-Xenotransplantat-Tumoren durch, die mit Etoposid ± AZD7648 behandelt wurden, um den Ort von DNA-Schäden und proliferierenden Zellen im Verhältnis zum Tumorgefäßsystem zu untersuchen. Die Einzelwirkstoffbehandlung mit einer relativ hohen Dosis von 40 mg/kg Etoposid führte nach 6 Stunden zu einer signifikanten DNA-Schädigung in FaDu-Tumoren. Die Färbung von p53BP1 wurde hauptsächlich in Regionen festgestellt, in denen sich funktionelle Blutgefäße (CD31) und proliferierende Zellen (EdU) befinden (repräsentative Bilder in Abb. 5A). Durch die Zugabe von 30 mg/kg AZD7648 wurde der Bereich der Zellen mit positivem DNA-Schaden erweitert, da die p53BP1-Färbung intensiver zu sein scheint und nun auch in Regionen mit weniger Blutgefäßen nachgewiesen wird.

Der DNA-PK-Inhibitor AZD7648 verstärkt DNA-Schäden, die in Xenotransplantat-Tumoren verursacht werden, die mit dem Top2-Gift Etoposid behandelt werden. (A) Repräsentative Bilder der EdU-, CD31- und p53BP1-IHC-Färbung von FaDu-Xenotransplantattumoren, die mit 40 mg/kg Etoposid (ip) als Einzelwirkstoff oder in Kombination mit 30 mg/kg AZD7648 (po) behandelt wurden. Nach 4 Stunden wurde den Tieren eine weitere Dosis von 60 mg/kg EdU (ip) verabreicht, wobei die Gewebe 6 Stunden nach der Chemotherapie-Behandlung entnommen wurden. (B) Auswertung der p53BP1-Signalintensität als Funktion der Entfernung von Blutgefäßen (CD31). Kontrollen, Etoposid- und Etoposid + AZD7648-Gruppen werden durch graue, blaue bzw. grüne Linien angezeigt. Die durchgezogene Linie stellt den Durchschnitt aller Experimente dar, während die gestrichelten Linien einzelne Wiederholungen darstellen. (C) Eine quantitative Analyse, die die p53BP1-Signalintensität in Bereichen in der Nähe von Blutgefäßen (15–65 µm) und weiter entfernt von Blutgefäßen (100–150 µm) zwischen Etoposid allein und Etoposid + AZD7648-Gruppen vergleicht, zeigt ein statistisch signifikantes Ergebnis (p ≤ 0,0001). für 15–65 µm, p ≤ 0,005 für 100–150 µm).

Unsere Ergebnisse zeigten, dass das EdU-Signal von Kontrolltumoren in der Nähe von Blutgefäßen (< 50 µm) seinen Höhepunkt erreichte und mit zunehmender Entfernung allmählich abnahm (Abb. 5A). Dies steht im Einklang mit den Merkmalen der Mikroumgebung solider Tumore, in der Zellen in der Nähe von Blutgefäßen proliferieren, während weiter entfernte Zellen nicht proliferieren und ruhen21,22,23. Es wurde eine quantitative Analyse durchgeführt, um die Intensität der p53BP1-Färbung als Funktion der Entfernung zu den nächstgelegenen CD31-gefärbten Blutgefäßen abzubilden. Die Färbung von p53BP1 in medikamentös behandelten Tumoren nimmt in den behandelten Gruppen in der Nähe der Blutgefäße zu einem Spitzenwert zu, bevor sie weiter entfernt wieder abnimmt. Während die Etoposid-Monogruppe jedoch zeigt, dass die p53BP1-Färbung bei Entfernungen weit von den Gefäßen auf die Kontrollwerte zurückkehrt, führt die Zugabe des DNA-PK-Inhibitors AZD7648 zu einem größeren Ausmaß an persistierenden p53BP1-markierten DNA-Schäden (Abb. 5B). Signifikante Anstiege der p53BP1-Intensität wurden zwischen Etoposid-Einzelbehandlungs- und Kombinationsgruppen für Regionen „in der Nähe von Blutgefäßen“ und „von Blutgefäßen entfernt“ beobachtet (p \(\le\) 0,0001 bzw. p \(\le\) 0,005) (Abb . 5C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Zugabe von DNA-PK-Inhibitoren nicht-proliferative Tumorzellen in vivo für die Behandlung mit Etoposid sensibilisiert.

Insgesamt haben wir in drei präklinischen Modellen gezeigt, dass DNA-PK-Inhibitoren Zellen für die Behandlung mit Top2-Gift sensibilisieren: Zellkultur, 3D-Sphäroide und tumortragende Mäuse. Im Vergleich zur alleinigen Top2-Hemmung deuten immunhistochemische Färbung und Durchflusszytometrieanalyse auf eine erhöhte DNA-Schädigung bei nicht-proliferierendem und G1-Phasen-Krebs und normalen Gewebezellen bei Behandlungen hin, bei denen Etoposid und DNA-PK-Inhibitoren kombiniert werden. Klonogene Überlebenstests und In-vivo-Studien zur Verzögerung des Tumorwachstums bestätigen, dass der beobachtete Anstieg der DNA-Schädigung bei Kombinationsbehandlungen im Vergleich zu Top2-Gift allein zu einer stärkeren Zelltötung und einer längeren Verzögerung des Tumorwachstums führt, allerdings wurden auch dosislimitierende Toxizitäten beobachtet. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Kombination von DNA-PK-Inhibitoren mit Top2-Giften ein wirksamer Behandlungsansatz ist, der in der Lage ist, nicht proliferierende, ruhende Tumorzellen abzutöten, die ansonsten gegen Behandlungen mit Top2-Giften resistent sind, was zu einer stärkeren Antikrebswirkung führt. Der beobachtete gleichzeitige Anstieg der Toxizität für nicht krebsartige Zellen legt jedoch nahe, dass die zelltötenden Wirkungen gezielt auf Tumorgewebe gerichtet werden müssen.

Wir haben gezeigt, dass DNA-PK-Inhibitoren wie AZD7648 die krebshemmende Wirkung von Top2-Giften verstärken, indem sie die Population der Zielzellen um die nicht proliferierenden, aber transkriptionell aktiven Zellen erweitern, die in der Tumormikroumgebung vorherrschen.

Die Zytotoxizität von Top2-Gift wird durch das Einfangen von Top2-Proteinen an den gebrochenen Enden der DNA vermittelt, wobei DNA-DSBs erzeugt werden, wenn der Protein-DNA-Komplex mit der Replikations- oder Transkriptionsmaschinerie kollidiert. Es gibt Hinweise darauf, dass Top2α die wichtigste Isoform ist, die in proliferierenden Zellen exprimiert wird, um die Replikation zu steuern, während Top2β in allen Zelltypen exprimiert wird, um die Transkription zu steuern24,25. Beide Isoformen können DNA-DSBs erzeugen, wenn sie von Top2-Giften eingefangen werden, obwohl Top2α-vermittelte replikationsabhängige Mechanismen die Hauptursache für die Zytotoxizität von Top2-Giften zu sein scheinen26,27. Unsere Ergebnisse zu DNA-Schäden und Zellüberleben stimmen mit diesen Mustern überein. Zellkultur- und 3D-Sphäroidmodelle zeigten, dass Top2α hauptsächlich in proliferierenden Zellen exprimiert wird und die Behandlung mit Etoposid den DNA-Schaden in dieser Population erhöhte, während die nicht proliferierende Fraktion zehnmal resistenter ist. Darüber hinaus zeigen Daten von Sphäroiden eine Dosis-Wirkungs-Beziehung für die zelltötende Wirkung von Etoposid, die bei einer signifikanten überlebenden Fraktion von > 40 % ein Plateau erreicht, selbst wenn die Konzentration um das Zehnfache erhöht wird, was auf eine signifikante Population resistenter Zellen schließen lässt (Abb. 1, 3). .

Top2β ist die andere Top2-Isoform, die sowohl in proliferierenden als auch in nicht proliferierenden Zellen exprimiert wird und hauptsächlich an der Transkription beteiligt ist, wie in unseren Sphäroiddaten bestätigt. Die beiden Isoformen haben den gleichen katalytischen Mechanismus und werden gleichermaßen von Top2-Giften angegriffen28,29, die Reparatur der resultierenden DSBs ist jedoch zellzyklusspezifisch, wobei NHEJ in allen Phasen des Zellzyklus beteiligt ist und HR nur in der späten S- bis G2-Phase aktiviert wird. Unsere Daten bestätigen erneut, was andere gezeigt haben, dass proliferierende Zellen im Vergleich zu nicht proliferierenden Zellen eine größere Empfindlichkeit gegenüber Top2-Giften haben, was impliziert, dass proliferierende Zellen weniger in der Lage sind, durch Top2-Gifte verursachte Schäden zu reparieren. Solide Krebsarten enthalten aufgrund der Komplexität der Mikroumgebungsgradienten der Sauerstoff- und Nährstoffversorgung eine gemischte Population proliferierender und nicht proliferierender Zellen, sodass nicht proliferierende Tumorzellen distal zu funktionellen Blutgefäßen gegen Top2α-zielgerichtete Antikrebswirkungen resistent sind30. HR ist ein relativ langsamer, aber präziser Prozess und eine hohe Dosis Top2-Gift kann DNA-DSBs induzieren, die die Kapazität zur HR-Reparatur überschreiten können31. Andererseits können die während der Transkription induzierten DSBs leichter über NHEJ repariert werden, einen Reparaturprozess, der im Vergleich zu HR32 schneller ist und eine größere Kapazität aufweist. Folglich haben nichtproliferative Zellen eine größere Chance, den durch Top2-Gifte verursachten DNA-Schaden durch NHEJ-Reparatur zu reparieren. Hinweise aus proteomischen Ansätzen stützen diese Hypothese weiter, indem sie zeigen, dass eingeschlossenes Top2 während der Replikation und Transkription durch verschiedene Mechanismen aus gebrochenen DNA-Enden entfernt wird33,34,35. Dies führt zu unterschiedlichen Formen von DNA-DSBs am 3‘-Ende zwischen Replikation und Transkription (lange vs. kurze 3‘-ssDNA-Überhänge), was die HR- bzw. NHEJ-Reparatur begünstigt. Abbildung 6 fasst die zellulären Reaktionen auf eingeschlossenes Top2 für Zellen zusammen, die sich einer Replikation oder Transkription unterziehen, sowie deren nachfolgendes Zellschicksal36.

Die vom Tumor verursachte Ruhe führt zu einer Population von Top2-giftresistenten Zellen, die durch DNA-PK-Hemmung angegriffen werden können. Während der Replikation wird eingeschlossenes Top2 durch Replikationsabfluss entfernt, wodurch lange Einzelstrangüberhänge am 3′-Ende der DNA zurückbleiben, was zum klassischen Zelltod durch Top2-Vergiftung führt. Während der Transkription wird das eingeschlossene Top2 zunächst durch das 26S-Proteasom abgebaut, gefolgt von der Tdp2-Spaltung, wodurch DNA-DSBs mit zwei stumpfen Enden zurückbleiben, die durch NHEJ effizient repariert werden können. Die Hemmung von DNA-PK blockiert den NHEJ-Signalweg, was zu einer neuartigen Art des durch Top2-Gift verursachten Zelltods führt.

Unsere Daten liefern Beweise, die das Argument stützen, dass NHEJ der entscheidende Reparaturweg für nicht proliferierende Zellen ist, um die durch die Top2-Vergiftungsbehandlung eingeführten DNA-DSBs zu reparieren. Die Blockierung des NHEJ-Signalwegs mit dem DNA-PK-Inhibitor AZD7648 sensibilisiert Tumorzellen für Etoposid und Doxorubicin, mit der größten Auswirkung auf nicht proliferierende Zellen. Färbedaten in Sphäroiden zeigen, dass Top2β sowohl in proliferierenden als auch in nicht proliferierenden Zellen, die durch den Einbau von EdU kartiert wurden, allgegenwärtig exprimiert wird und sich mit dem Transkriptionsprofil von Sphäroiden überschneidet, die durch den Einbau von EU kartiert wurden. Die Zugabe von DNA-PK-Inhibitoren verstärkte die DNA-Schädigung sowohl proliferierender als auch nicht proliferativer, aber transkriptionell aktiver Zellen. Dieser größere DNA-Schaden führte zu einer stärkeren Zelltötung in vitro und einer erhöhten Antitumorwirkung in vivo, wie das Ergebnis der Kombination des DNA-PK-Inhibitors mit Top2-Giften in klonogenen Überlebens- und Tumorwachstumsverzögerungstests zeigt. Insgesamt deuten unsere Erkenntnisse darauf hin, dass Top2-Gifte am wirksamsten Zellen abtöten, die nicht in der Lage sind, den Schaden zu reparieren, wobei es sich offenbar vorzugsweise um HR-abhängige Zellen in der S-Phase handelt. Ruhende Zellen, die NHEJ nutzen können, um die während der Transkription durch Top2β-Vergiftung auftretenden DNA-DSBs zu reparieren, sterben mit geringerer Wahrscheinlichkeit ab. Dies kann jedoch durch Hemmung des Schlüssel-NHEJ-Proteins DNA-PK überwunden werden. Ebenso wurde festgestellt, dass die Hemmung anderer Komponenten des NHEJ-Signalwegs die Zytotoxizität von Top2-Giften erhöht. Srivastava et al. hat gezeigt, dass ein Ligase-IV-Inhibitor, SCR7, den NHEJ-Signalweg hemmt und bei Behandlung in Kombination mit Etoposid eine bessere Tumorkontrolle verleiht. Der detaillierte molekulare Mechanismus, der zur Zytotoxizität und den Zielzellpopulationen führt, wurde jedoch nicht untersucht37.

Trotz der erheblichen Verzögerungen des Tumorwachstums, die in unseren In-vivo-Studien erzielt wurden, waren die nachteiligen Auswirkungen in den Kombinationsbehandlungsgruppen offensichtlich. Da die meisten postmitotischen normalen Gewebe ebenfalls nicht proliferativ, aber transkriptionell aktiv sind, kann diese Kombinationstherapie zu einer Verringerung des therapeutischen Index für Top2-Gifte führen und damit den Dosisbereich einschränken, in dem Top2-Gifte ohne inakzeptable Nebenwirkungen wirksam sein können. In unseren Kombinationsbehandlungsgruppen wurden mittelschwere bis schwere Toxizitäten beobachtet, wobei die höchste Dosis von AZD7648 in Kombination mit normalerweise gut verträglichen 5 mg/kg Etoposid in der ersten Behandlungswoche zu einem übermäßigen Gewichtsverlust führte, was eine humane Beendigung der Studie bei den Tieren erforderlich machte. Der Gewichtsverlust könnte das Ergebnis einer übermäßigen Toxizitätsbelastung des Darms sein, einem stark proliferierenden Organ mit hoher Empfindlichkeit gegenüber toxischer Chemotherapie. Es wurde festgestellt, dass pegyliertes liposomales Doxorubicin (PLD) aufgrund einer längeren Plasmahalbwertszeit bei niedrigeren Spitzenkonzentrationen eine größere Tumor-Targeting-Spezifität aufweist38. In den Kombinationsbehandlungsgruppen kam es weiterhin zu Toxizität bei PLD, sie war jedoch deutlich geringer als bei Etoposid. Andere Gruppen, die Top2-Gifte mit DNA-PK-Inhibitoren kombinieren, haben über ähnliche Wirksamkeitsergebnisse bei der Krebsbekämpfung berichtet, berichten jedoch auch über Toxizität, mit 15 %12 und 10 %11 Körpergewichtsverlust bei Tieren, die mit PLD (2,5 mg/kg) + AZD7648 behandelt wurden ( 37,5 mg/kg) im Vergleich zu PLD allein. Diese Toxizität kann jedoch überwunden werden, wenn eine stärker lokalisierte Chemotherapie angewendet wird, beispielsweise durch die Verwendung von DC-M1-Polymerkügelchen, die mit Chemotherapeutika beladen sind39. Andere Methoden zur Begrenzung der Toxizität und zur Festlegung eines therapeutischen Verhältnisses in der Klinik umfassen eine sorgfältige Dosierung und Behandlungsplanung, um die Abtötung von Krebszellen zu optimieren und gleichzeitig dosislimitierende Toxizitäten zu minimieren. Mathematische Modelle, die Zellzyklus, DNA-Schäden und Reparaturkinetik berücksichtigen, wurden verwendet, um die Reaktion von Xenotransplantaten in vivo vorherzusagen und tolerierbare Dosierungspläne für die Behandlung zu erstellen, wie dies auch im klinischen Phase-I-Studiendesign für den ATR-Inhibitor AZD6738 in Kombination mit Strahlentherapie verwendet wurde40. Dieser Ansatz könnte einen Weg für eine wirksame Kombination von Top2-Giften mit DNA-Schadensreparaturinhibitoren bieten.

Zusammenfassend führt die Zugabe von DNA-PK-Inhibitoren zu Top2-Giften zu einem synergistischen Effekt mit der größten Wirkung auf nicht proliferierende Zellen, da diese ansonsten resistenten Zellen sensibilisiert werden, was zu größeren oder anhaltenderen DNA-Schäden und einer signifikanten Verringerung des Überlebens von Tumorzellen führt. Die Sensibilisierung von nicht krebsartigem, normalem Gewebe und die bei Kombinationsbehandlungen beobachteten insgesamt größeren dosislimitierenden Toxizitäten legen jedoch nahe, dass ein gezielterer therapeutischer Ansatz erforderlich ist, um den potenziellen Nutzen der Kombination von Top2-Vergiftung und DNA-PK-Hemmung zu maximieren.

Alle Roh- und verarbeiteten Daten werden auf Anfrage dem entsprechenden Autor zur Verfügung gestellt.

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Taixiang Wang, Alastair H. Kyle, Jennifer HE Baker, Nannan A. Liu, Judit P. Banáth und Andrew I. Minchinton

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TW führte die Experimente durch und verfasste den Haupttext des Manuskripts. AIM, AHK und JHEB trugen zum Experiment- und Projektdesign sowie zur Manuskriptbearbeitung bei. JPB und NAL trugen zur Datenerhebung bei. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Andrew I. Minchinton.

AHK, JHEB und AIM werden als Erfinder eines Patents und von Patentanmeldungen zu neuartigen DNA-PK-Inhibitoren genannt. Die anderen Autoren geben an, dass keine potenziellen Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wang, T., Kyle, AH, Baker, JHE et al. Die DNA-PK-Hemmung weitet die therapeutische Wirkung der Top2-Vergiftung auf nicht proliferierende Zellen aus und erhöht die Aktivität auf Kosten. Sci Rep 13, 12429 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39649-7

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Eingegangen: 09. Mai 2023

Angenommen: 28. Juli 2023

Veröffentlicht: 01. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39649-7

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